乳癌組織中Pax1的表達及其對乳癌MDA-MB-231細胞生物學行為的影響

趙志華，陳可欣

天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院 天津 300060

乳癌組織中Pax1的表達及其對乳癌MDA-MB-231細胞生物學行為的影響

趙志華，陳可欣#

天津醫(yī)科大學腫瘤醫(yī)院 天津 300060

#通訊作者，女，1963年11月生，博士，主任醫(yī)師，研究方向：腫瘤臨床，E-mail：sunjingyan126@126.com

乳癌；配對盒家族基因1；MDA-MB-231 細胞

目的：研究Pax1在乳癌組織中的表達及其對乳癌MDA-MB-231細胞生物學行為的影響。方法采用Western blot檢測200乳腺原發(fā)癌和癌旁組織中Pax1蛋白的表達。采用化學合成針對Pax1基因的兩個小干擾RNA(siRNA- Pax1-1和siRNA- Pax1-2)下調該基因的表達，應用MTT和Transwell實驗檢測其對MDA-MB-231細胞生物學行為的影響。結果Pax1在乳腺原發(fā)癌組織中的表達低于相應的癌旁組織，沉默Pax1表達可促進乳癌細胞增殖、遷移和侵襲(F=52.413和72.741，P<0.001)。結論Pax1有望成為乳癌早期診斷和預測預后的生物分子標志物。

乳癌是女性最常罹患的惡性腫瘤[1]，其本質是一種多基因異常疾病，通過原癌基因的過表達，同時伴隨抑癌基因的突變缺失，從而使腫瘤細胞逃避了正常生長的調控機制[2]。從根本上糾正與乳癌發(fā)生發(fā)展相關的基因異常的基因治療已成為醫(yī)學研究領域的熱點[3]。Lai等[4]首次研究發(fā)現(xiàn)，配對盒家族基因1(paired boxed gene 1，Pax1)基因在宮頸癌中出現(xiàn)異常甲基化，甲基化異常頻率可達94.5%，提示Pax1在宮頸癌的早期發(fā)現(xiàn)中具有重要作用。但目前對于Pax1在乳癌發(fā)生發(fā)展中的研究目前尚未見報道。作者檢測Pax1蛋白在乳癌組織及相應的癌旁正常組織標本的表達情況，觀察沉默Pax1基因表達對乳癌MDA-MB-231細胞生物學的影響，以期為深入研究乳癌細胞的分子病理機制提供新線索和策略。

1 材料與方法

1.1標本來源200例乳腺原發(fā)癌及其癌旁正常組織標本取自2004年9月至2010年1月天津醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院收治的乳癌患者，所有患者術前均未行放療和化療。組織樣本經液氮速凍后-80 ℃保存。所有樣本采集和使用均征得患者同意并簽署知情同意書，并由天津醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院倫理委員會同意使用。

1.2Pax1蛋白的檢測采用Western blot法。40 μg總蛋白經80 V電壓電泳3 h后，轉印至PVDF膜。TBS-T(pH 8.3)液室溫封閉1 h后加入兔抗人Pax1一抗(英國Abcam公司)，4 ℃平搖過夜，TBS-T洗膜6次后加入辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗(美國Santa Cruz公司)，室溫孵育1 h，TBS-T洗膜6次， 加ECL (美國GE Healthcare 公司)，顯色1～2 min。用ChemiDoc XRS凝膠成像系統(tǒng)(美國BIO-RAD公司)照相分析。

1.3細胞實驗

1.3.1 實驗分組和處理 MDA-MB-231細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清(FBS)、100 U/mL 青霉素和 100 g/L鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基(Invitrogen公司)，于37 ℃、體積分數(shù)5% CO2培養(yǎng)至對數(shù)生長期。接種2×105個細胞/孔于6孔板，以無抗生素的含血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。實驗為4組?？瞻讓φ战M：無處理的MDA-MB-231細胞；轉染對照組：轉染si-control；轉染1組：轉染siRNA-Pax1-1；轉染2組：轉染siRNA-Pax1-2。si-control、siRNA-Pax1-1和siRNA-Pax1-2均由上海吉瑪公司合成，轉染操作嚴格按照試劑盒說明書進行。100 nmol/L siRNA-PAX1-1、siRNA-PAX1-2 分別與2 μL Lipofectamine 2000各溶于50 μL培養(yǎng)基，孵育5 min后混合20 min，緩慢滴入置于500 μL OPTI-DMEM無血清培養(yǎng)基的細胞中，6 h后將培養(yǎng)液更換為含血清的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)。

1.3.2 細胞增殖能力檢測 采用MTT法。4組細胞分別處理48 h后，胰酶消化對數(shù)期細胞，終止后離心收集，制成細胞懸液，細胞計數(shù)調整其濃度至 1 000～10 000/孔。體積分數(shù)5% CO2，37 ℃孵育，至細胞單層鋪滿孔底，設3個復孔,于 24、48、72 h后每孔加入10 mL 5 g/L MTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心用PBS沖2～3遍后。每孔加入100 μL二甲基亞砜，置搖床上低速振蕩10 min，在酶聯(lián)免疫檢測儀檢測570 nm處測量各孔的吸光光度(A)值。計算細胞增殖抑制率[5]。

1.3.3 細胞侵襲和遷移能力檢測 采用Transwell實驗。每組均將懸浮于500 μL無血清培養(yǎng)基的5×104個細胞分別接種于含和不含Matrigel的Transwell上室，下層加入750 μL含體積分數(shù)10%FBS的細胞培養(yǎng)液，培養(yǎng)8 h。取出Transwell小室，用棉簽拭去上層未穿過的細胞，蘇木素染色后封片，于鏡下觀察穿膜細胞數(shù)目。

1.4統(tǒng)計學處理采用SPSS 17.0分析。各組細胞增殖抑制率和穿膜細胞數(shù)目的比較采用單因素方差分析和LSD-t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1乳癌組織和癌旁正常乳腺組織中Pax1的表達乳癌組織中Pax1蛋白的表達低于癌旁正常乳腺組織(圖1)。

2.2 4組細胞Pax1蛋白的表達轉染1組和2組中Pax1表達水平較對照組降低，見圖2。

圖1 2種組織中Pax1蛋白的表達

圖2 轉染效率鑒定

1：空白對照組；2：轉染對照組；3：轉染1組；4： 轉染2組。

2.3沉默Pax1對乳癌細胞體外生物學行為的影響見表1。

表1 4組細胞中細胞增殖和穿膜細胞數(shù)目的比較

*:與對照組比較，P<0.05；#：與轉染1組比較，P<0.05。

3 討論

Pax1基因位于20p11.2，分布于細胞核。Pax基因家族分為4類：1類和3類在維護組織特異干細胞中發(fā)揮至關重要的作用，并發(fā)現(xiàn)其在多種惡性腫瘤的發(fā)展中過表達；1類和4類包括Paxl、Pax4、Pax6和Pax9，在惡性腫瘤中常表達受抑。文獻[6]報道，乳癌早期組織中Pax6啟動子高甲基化且低表達，Hus等[7]研究發(fā)現(xiàn)在肺癌組織中Pax9低表達，且Pax9高表達患者具有良好的預后。Hata等[8]發(fā)現(xiàn)，Pax6對膠質瘤細胞具有抑制功能，而Pax4則對人類黑色素瘤具有抑制作用，Pax基因家族在不同腫瘤中發(fā)揮著不同的作用，與腫瘤的良惡性相關，因此抑制Pax可以成為一個新的治療靶點。研究[5]報道Pax1參與骨骼發(fā)育、轉錄、調控轉錄，是一種重要的轉錄因子，被認為是抑癌基因，其啟動CpG島甲基化是其在表觀遺傳學上的重要調節(jié)方式，與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉移密切相關。

該研究發(fā)現(xiàn)乳癌組織中Pax1蛋白的表達下降，提示Pax1在乳癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。作者將針對Pax1的siRNA轉染乳癌細胞系MDA-MB-231，檢測到較轉染非特異性siRNA的細胞Pax1蛋白表達減少，說明轉染有效。 MTT檢測發(fā)現(xiàn)低表達Pax1的乳癌MDA-MB-231細胞增殖能力明顯提高；Transwell小室實驗發(fā)現(xiàn)低表達Pax1的乳癌MDA-MB-231細胞的遷移和侵襲能力明顯增強。

該研究使用針對Pax1的siRNA沉默該基因表達對MDA-MB-231細胞在增殖、遷移和侵襲方面的影響，提示Paxl在乳癌的發(fā)生、發(fā)展中可能發(fā)揮潛在的抑癌基因作用，其機制有待進一步實驗驗證。

[1]Valentin MD, da Silva SD, Privat M, et al. Molecular insights on basal-like breast cancer[J].Breast Cancer Res Treat, 2012, 134(1):21

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[3]Parker JS, Mullins M, Cheang MC, et al. Supervised risk predictor of breast cancer based on intrinsic subtypes[J].J Clin Oncol, 2009, 27(8) :1160

[4]Lai HC，Lin YW，Huang TH，et al．Identification of novel DNA methylation marker in cervical cancer[J].Int J Cancer，2008，123(1)：161

[5]Burgess R，Rawls A，Brown D，et al．Requirement of the paraxis gene for somite formation and musculoskeletal patterning[J].Nature,1996，384(6609):570

[6]Moelans CB，Verschuur-Maes AH，van Diest PJ．Frequent promoter hypermethylation of BRCA2，CDHl3，MSH6，PAX5，PAX6 and WTl in ductal carcinoma in situ and invasive breast cancer[J]．J Pathol，2011，225(2)：222

[7]Hsu DS，Acharya CR，Balakumaran BS，et al.Characterizing the developmental pathways TTF-1，NKX2-8，and PAX9 in lung cancer[J]．Pro Natl Acad SCI USA，2009，106(13)：5312

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(2013-12-04收稿 責任編輯李沛寰)

Expression of Pax1 in breast cancer tissue and influence on proliferation and apoptosis of MDA-MB-231 cells

ZHAOZhihua,CHENKexin

CancerHospital,TianjinMedicalUniversity,Tianjin300060

breast cancer;paired boxed gene 1;MDA-MB-231 cell

Aim: To investigate the expression of paired boxed gene 1 (Pax1) gene in breast cancer tissue and to explore the influence on proliferation status, migration ability and metastatic ability of breast cancer cells MDA-MB-231．Methods: Western blot were used to examine the expression of Pax1 in samps, including 200 normal tissues and 200 primary tumors. MTT and transwell were used to analyze the ability of proliferation, migration, and invasion in Pax1 siRNA-transfected MDA-MB-231 cells. Results: The expression of Pax1 was lower in breast cancer tissues than other tissues. Furthermore, knockdown of Pax1 expression resulted in increased proliferation and invasion in MDA-MB-231 cells in vitro(F=52.413 and 72.741，P<0.001). Conclusion: The expression of Pax1 gene shows and obvious downgraded in breast cancer tissue.Low expression of Pax1 gene can increase apeptosis and proliteration of MDA-MB-231 cells, which may provide a strategy for blocking breast cancer and progression.

10.13705/j.issn.1671-6825.2014.04.022

R737.9