復(fù)元膠囊對兔膝骨關(guān)節(jié)炎MMP-3、IL-1及SOD含量的影響

代葉紅 李榮亨 龍再現(xiàn)

·論著·

復(fù)元膠囊對兔膝骨關(guān)節(jié)炎MMP-3、IL-1及SOD含量的影響

代葉紅 李榮亨 龍再現(xiàn)

目的觀察復(fù)元膠囊對兔膝骨關(guān)節(jié)炎(KOA)軟骨組織變化及血清中超氧化物歧化酶(SOD)活性、白細胞介素-1(IL-1)、基質(zhì)金屬蛋白酶3(MMP-3)含量的影響。方法新西蘭兔32 只，隨機分為復(fù)元膠囊組、壯骨關(guān)節(jié)丸組、模型組和正常組，除正常組外，其余各組均按照Hulth法造模建立膝KOA動物模型，復(fù)元膠囊組、壯骨關(guān)節(jié)丸組分別給予復(fù)元膠囊組、壯骨關(guān)節(jié)丸灌胃，正常組及模型組給予0.9%氯化鈉溶液。灌胃4周后分別隨機選取6只采取血清檢測SOD活性及MMP-3、白細胞介素-1(IL-1)的含量，采用HE染色光鏡觀察軟骨組織病理改變。結(jié)果復(fù)元膠囊組軟骨細胞明顯增加，微血管管壁基本恢復(fù)正常，復(fù)元膠囊組血清中MMP-3、IL-1含量低于其他組(P<0.05)； SOD含量高于其他組(P<0.05)。結(jié)論使用復(fù)元膠囊可顯著降低兔膝關(guān)節(jié)局部MMP-3、白細胞介素-1(IL-1)的含量，提高SOD的活性，從而有利于抑制滑膜炎癥，緩解 KOA 早期的疼痛、腫脹癥狀，延緩關(guān)節(jié)軟骨的退變。

復(fù)元膠囊; 骨關(guān)節(jié)炎；血清超氧化物歧化酶活性；白細胞介素-1、基質(zhì)金屬蛋白酶3

骨關(guān)節(jié)病好發(fā)于老年人，60歲以上人群患病率高達50%以上，75歲以上人群則達80%，隨著我國老齡化不斷加劇，膝骨性關(guān)節(jié)炎(KOA)引起生活質(zhì)量下降，是嚴(yán)重危害中老年人的主要疾病。我們在長期的臨床實踐中總結(jié)出KOA的基本病機是肝腎不足、血瘀阻絡(luò)，并在此基礎(chǔ)上運用補益肝腎、強筋壯骨、化瘀通絡(luò)的治法，擬方復(fù)元膠囊，通過建立兔KOA模型，灌胃4周后觀察兔膝關(guān)節(jié)滑液中細胞因子MMP-3、白細胞介素-1(IL-1)及SOD含量的影響，以及關(guān)節(jié)軟骨組織變化，發(fā)現(xiàn)復(fù)元膠囊能緩解膝關(guān)節(jié)疼痛、改善功能有很好的療效，探索中藥復(fù)方治療KOA的作用機制。

1 材料與方法

1.1 動物與分組 健康新西蘭大白兔32只，體重(2.5± 0.1)kg，購自重慶醫(yī)科大學(xué)動物中心，動物合格證號：SCICK(渝) 2007-0001。隨機分為4組：復(fù)元膠囊組、壯骨關(guān)節(jié)丸組、模型組和正常組，每組8只，給藥4周。

1.2 實驗藥品及試劑 MMP-3、IL-1、SOD試劑盒均由南京建成生物工程研究所提供。復(fù)元膠囊由淫羊藿、鹿茸、黃芪、生曬參、續(xù)斷、丹參、川芎、枸杞子等組成，由重慶希爾安藥業(yè)股份有限公司加工生產(chǎn)， 壯骨關(guān)節(jié)丸由深圳華潤三九醫(yī)藥股份有限公司生產(chǎn)。

1.3 造模方法 采用改良 hulth 法構(gòu)建兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型，速眠新Ⅱ0.2 ml/kg肌注麻醉后，選右后肢外側(cè)，髕腱旁縱形切口，長約6 cm，切開關(guān)節(jié)囊，向內(nèi)側(cè)推開髕骨，充分顯露兔膝關(guān)節(jié)，剪斷前后交叉韌帶并切除外側(cè)半月板，避免損傷關(guān)節(jié)面軟骨，0.9%氯化鈉溶液沖洗關(guān)節(jié)腔，逐層縫合切口，無菌包扎固定。術(shù)后所有動物每天驅(qū)趕60 min。

1.4 給藥方法 造模后 1周開始給藥，復(fù)元膠囊組每只每次灌胃劑量為 0.727 g·kg-1·d-1，每天灌胃3次，壯骨關(guān)節(jié)丸組每只每次一丸、每天灌胃3次，模型組每天灌予10 ml 0.9%氯化鈉溶液，正常組不給予任何藥物。每組均連續(xù)灌胃4周后處死動物。

1.5 觀察指標(biāo) 分別與造模前、造模后，治療中、治療完畢后將實驗動物處死，心腔內(nèi)取血5 ml，4℃靜置過夜,3 000 r/min離心 20 min,取上清液，經(jīng)0.22 μm抽濾除菌后分裝,-20℃保存?zhèn)溆?。用氧化還原酶法測定SOD含量，用放免法測定MMP-3，用硝酸還原酶法測定IL-1含量。

2 結(jié)果

2.1 直視觀察 直視下見關(guān)節(jié)承重區(qū)的軟骨變軟、碎裂、軟骨全層破壞、大部分軟骨下骨質(zhì)裸露、骨面下骨牙質(zhì)變。

2.2 光鏡下觀察 正常組軟骨細胞無異常(圖1)。將實驗兔造模后和冶療后的關(guān)節(jié)軟骨進行病理學(xué)分析。造模后病理：可見軟骨細胞明顯減少，骨面下骨髓腔內(nèi)血管和纖維組織增生(圖2)。冶療4周后，壯骨關(guān)節(jié)丸組末有明顯變化(圖3)，復(fù)元膠囊組軟骨細胞明顯增加，微血管管壁基本恢復(fù)正常(圖4)。

圖1 正常組可見軟骨細胞無異常(HE×400)

圖2 模型組可見軟骨面下骨髓腔內(nèi)血管和纖維組織增生(HE×400)

圖3 壯骨關(guān)節(jié)丸組：軟骨骨面下骨髓腔內(nèi)微血管管壁增厚、變形(HE×400)

圖4 復(fù)元膠囊組：軟骨細胞明顯增加、微血壁基本恢復(fù)正常(HE×400)

2.3 治療4周后血清中MMP-3、IL-1、SOD含量 SOD含量：復(fù)元膠囊組SOD含量明顯升高，與壯骨關(guān)節(jié)丸組、模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；MMP-3、IL-1含量：復(fù)元膠囊組MMP-3、IL-1含量明顯降低，與壯骨關(guān)節(jié)丸組、模型組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與正常組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 治療4周后血清中MMP-3、IL-1、SOD含量

表1 治療4周后血清中MMP-3、IL-1、SOD含量

組別SOD(μmol/L)IL-1(μmol/L)MMP-3(μg/L)正常組392±16112±14136±37模型組221±23* 341±17*259±17*壯骨關(guān)節(jié)丸組251±24* 264±15*201±18*復(fù)元膠囊組378±32139±35142±13

注：與復(fù)元膠囊組比較，*P<0.05

3 討論

KOA是由于關(guān)節(jié)軟骨破壞、變性、骨質(zhì)增生為特征的慢性關(guān)節(jié)病，臨床上以膝關(guān)節(jié)腫痛、骨質(zhì)增生及活動受限最為常見[1]。KOA發(fā)病的主要原因有生物力學(xué)損傷、機械性損傷、遺傳因素等，其中主要是機械性損傷。關(guān)節(jié)軟骨細胞的代謝大多數(shù)為無氧代謝途徑[2，3]，軟骨基質(zhì)在特定酶的作用下導(dǎo)致降解，其中外源性酶，如基質(zhì)金屬蛋白酶-3，可能生成于關(guān)節(jié)滑膜，然后被分泌到來自A型和B型滑膜內(nèi)襯細胞的溶酶體的滑膜液中，在病理情況下，當(dāng)多形核粒細胞和巨噬細胞進入關(guān)節(jié)腔時，它們分泌出膠原酶、溶解酶或中性蛋白酶，導(dǎo)致軟骨降解，致使滑膜、軟骨和骨的代謝改變，產(chǎn)生炎癥、關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)破壞。另外細胞因子如白細胞介素-1(IL-1)，能刺激基質(zhì)金屬蛋白酶-3的前體，最終導(dǎo)致軟骨基質(zhì)的降解；也可通過刺激關(guān)節(jié)滑膜細胞增殖和變性，促進滑膜細胞金屬蛋白酶分泌，抑制或干擾軟骨細胞表達。伍捷進研究表明KOA患者血清及關(guān)節(jié)液中MMP-3含量與IL-1)成正相關(guān)[4]。超氧化物歧化酶(SOD)是一種新型酶制劑，能提高機體抗氧自由基系統(tǒng)的能力，甚至消除關(guān)節(jié)和血清中過多的氧自由基IL-1和IL-1，保護軟骨細胞進一步受損傷，延緩軟骨退變，促進軟骨修復(fù)作用，與李喜輝等[5]的實驗研究證實一致。

祖國醫(yī)學(xué)認為膝骨關(guān)節(jié)炎屬痹證、骨痹范疇，《內(nèi)經(jīng)》云:“腎主骨、肝主筋，膝為筋之府”。易君山認為主要是肝腎不足、瘀血阻滯[6]，治療上張文柱[7]以溫?zé)嶂畡┭词怪?；杜見斌[8]認為應(yīng)以益肝補腎通絡(luò)為法。我們選用復(fù)元膠囊，以補益肝腎、強筋壯骨、化瘀通絡(luò)為主，通過實驗證明復(fù)元膠囊能夠降低KOA關(guān)節(jié)液中MMP-3及IL-1的含量，提高SOD的濃度，具有保護關(guān)節(jié)軟骨、延緩軟骨退變，緩解關(guān)節(jié)疼痛，為臨床治療提供理論依據(jù)。

1 鄧廉夫，柴本甫.IL-21，TNF和IL-26與骨關(guān)節(jié)炎.國外醫(yī)學(xué)創(chuàng)傷與外科基本問題分冊，1996，5：102-106.

2 Gylys-Morin VM,Hajek PC,Sarrtoris DJ,et al.Articular cartilsge defects:Detectability in cadaver knees with MR.AJR Am J Roentgenol，148：1153-1157.

3 Wolff SD,Chesnick S,Frank JA,et al.Magnetization transfer contrast：MR imaging of the knee.Radiology，1991：179，623-628.

4 伍捷進，吳啟富.健骨顆粒沖劑對膝骨關(guān)節(jié)炎大鼠血清和關(guān)節(jié)液中腫瘤壞死因子-α及基質(zhì)金屬蛋白酶-3的影響.中醫(yī)正骨，2012，24：20-22.

5 李喜輝，白書臣，樊晨暉，等.骨痛膜對兔膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎血清中SOD、NO、HA含量影響的實驗研究.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2009，18：3931-3932，3981.

6 易君山，陳平艷.自擬健骨蠲痹湯治療膝骨性關(guān)節(jié)炎163例.中國民族民間醫(yī)藥，2008，17：60-61.

7 張文柱.增生性膝關(guān)節(jié)炎臨床治療觀察.天津中醫(yī)，1993，17：27.

8 杜見斌.益肝補腎通絡(luò)法治療骨性關(guān)節(jié)炎96例.山東中醫(yī)雜志，1992,11：23.

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.08.015

400016 重慶市，重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科(代葉紅、李榮亨)；重慶市秀山縣人民醫(yī)院骨科(龍再現(xiàn))

R 684.3

A

1002-7386(2014)08-1161-02

2013-11-12)