響應(yīng)面優(yōu)化酶法澄清琯溪蜜柚汁工藝研究

許 鍵，蔡慧農(nóng),2,3，倪 輝,2,3，杜希萍,2,3，黃高凌,2,3

(1.集美大學(xué)生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021； 2.福建省高校食品微生物與酶工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361021；3.廈門市食品與生物工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361021)

響應(yīng)面優(yōu)化酶法澄清琯溪蜜柚汁工藝研究

許 鍵1，蔡慧農(nóng)1,2,3，倪 輝1,2,3，杜希萍1,2,3，黃高凌1,2,3

(1.集美大學(xué)生物工程學(xué)院，福建 廈門 361021； 2.福建省高校食品微生物與酶工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361021；3.廈門市食品與生物工程技術(shù)研究中心，福建 廈門 361021)

以琯溪蜜柚為主要原料，利用響應(yīng)面法對酶法澄清琯溪蜜柚汁工藝進(jìn)行優(yōu)化.在單因素基礎(chǔ)上選取試驗因素與水平，根據(jù) Box-Benhnken 試驗設(shè)計原理，采用三因素三水平的響應(yīng)面分析法，對各個因素的顯著性和交互作用進(jìn)行分析，以透光率為響應(yīng)值作響應(yīng)面曲線圖和等高線圖，并建立了工藝數(shù)學(xué)模型.結(jié)果表明：酶法澄清蜜柚汁工藝的最佳參數(shù)為果膠酶濃度200 U/mL、酶解溫度49 ℃、酶解時間40 min；并對結(jié)果進(jìn)行驗證，在此條件下，蜜柚汁透光率為97.2%，與預(yù)測值97.5%接近.說明，根據(jù)Box-Behnken模型并采用響應(yīng)面分析法得到的酶法澄清蜜柚汁優(yōu)化工藝準(zhǔn)確、可靠.

琯溪蜜柚汁；酶法澄清；優(yōu)化；響應(yīng)面

0 引言

澄清汁在保持果汁原有風(fēng)味的基礎(chǔ)上，可使果汁產(chǎn)品的穩(wěn)定性、色澤和外觀大大改善.因此，澄清果汁在果汁及飲料產(chǎn)品中占有越來越重要的地位[1].琯溪蜜柚由于果實品質(zhì)好、皮薄多汁、清甜醇蜜、酸甜適中、成熟期早等諸多優(yōu)勢而深受果農(nóng)和消費者的歡迎，市場占有率逐年增加，目前已成為福建占領(lǐng)國內(nèi)外市場的主要果品之一[2].琯溪蜜柚不僅是美味果品，更是天然的保健食品.據(jù)文獻(xiàn)[3-6]報道，每100 mL果汁含可溶性固形物10.7～11.6 g、糖9.17～11.6 g、酸0.73～1.0 g、維生素C 48.93～51.98 mg，同時含有鎂、鈣、銅、鐵、鋁、鈦、錳、釩、磷、氯等10多種對人體有益的礦物質(zhì)元素.蜜柚果汁還含有大量的果膠，以及大量的纖維素、半纖維素等物質(zhì)，這些物質(zhì)能促進(jìn)腸道蠕動，增強腸胃功能，降低血液中膽固醇的含量，起到保護(hù)心血管的功能.但這些物質(zhì)也使得柚子汁加工過程中和保質(zhì)期內(nèi)易發(fā)生沉淀、絮凝等現(xiàn)象，影響產(chǎn)品的外觀和口感，從而嚴(yán)重影響了柚汁的商業(yè)價值.隨著蜜柚果汁脫苦加工技術(shù)的完善，柚子果汁生產(chǎn)中的澄清將是一個亟待解決的重要技術(shù)，也是蜜柚果汁加工的關(guān)鍵環(huán)節(jié). 由壓榨方法制得的原果汁中出現(xiàn)的果實細(xì)胞碎片、一些不溶性成分和一些固體大分子物質(zhì)(如多酚類物質(zhì)、蛋白質(zhì)、果膠、纖維素等)，這些物質(zhì)將引起果汁渾濁，導(dǎo)致果汁在儲藏期間出現(xiàn)品質(zhì)惡化，使果汁的貯藏期明顯縮短.文獻(xiàn)研究表明[7-8]，生產(chǎn)澄清果汁可以解決此問題.目前在果汁生產(chǎn)中常用的澄清方法主要有自然澄清法、離心分離法、熱處理法、冷凍法、酶法、澄清劑法和超濾法等[9-11].果膠酶是酶法澄清工藝中最常用的酶制劑，它能水解呈負(fù)電性的果膠物質(zhì)，使果汁中其他大分子和帶正電顆粒失去果膠的保護(hù)作用，通過靜電平衡，和還沒有完全分解的帶負(fù)電的果膠分子凝聚，中和而沉淀，使之達(dá)到澄清凈化的效果[12].澄清型柚子汁及其飲料是國際市場需求的新動向，國內(nèi)尚未見其開發(fā)應(yīng)用的報道.本文研究了果膠酶用量、酶解溫度、酶解時間對琯溪蜜柚汁澄清效果的影響，通過響應(yīng)面試驗優(yōu)化確定酶解的最佳工藝條件.

1 材料與方法

1.1 材料

琯溪蜜柚，購自漳州市平和縣；商品果膠酶制劑(5×105U/g)，購自和氏璧生物技術(shù)有限公司.

1.2 儀器設(shè)備

HH-4 型恒溫水浴鍋，常山國華電器有限公司；Unic7200型紫外可見分光光度計，尤尼柯(上海)儀器有限公司；101-3B型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱，上海市實驗儀器總廠；BS223S型電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器；LXJ-IIB型低速大容量離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠.

1.3 方法

1.3.1 蜜柚澄清汁的制備 原料選擇→清洗→去皮→囊瓣分離、去囊衣→取囊瓣→打漿→壓榨擠汁→原汁→澄清→離心過濾→清汁備用.

1.3.2 離心澄清工藝 取蜜柚汁原汁5 mL，在25 ℃下于3000、3500、4000 r/min 離心，時間分別為5、10、15、20、25、30、35 min，取上層清液測定透光率，探討離心對蜜柚原汁澄清度的影響.

1.3.3 自然靜置澄清工藝 取蜜柚汁原汁5 mL，在25 ℃下分別靜置1，2，3，4，5 h，取上層清液測定透光率，探討靜置時間對蜜柚原汁澄清度影響.

1.3.4 蜜柚汁果膠酶澄清工藝 取蜜柚汁原汁5 mL，分別取果膠酶 100、200、300、400、500、600、700 U/mL ，在 25、30、35、40、45、50、55、60、65、70 ℃下 ，酶解15、30、45、60、75、90、105、120 min，煮沸10 min滅酶后冷卻備用.在單因素基礎(chǔ)上，以酶用量、酶解溫度和酶解時間為因素，采用響應(yīng)面進(jìn)行優(yōu)化試驗，確定最佳酶解條件.

1.3.5 透光率測定 采用分光光度法.果汁經(jīng)3000 r/min離心5 min，取上清液以蒸餾水作參比，比色杯厚 1 cm，在 660 nm 處測定果汁的透光率T.

1.4 數(shù)據(jù)分析

根據(jù)試驗所得蜜柚果汁透光率變化數(shù)據(jù)，采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行統(tǒng)計分析并繪圖；采用設(shè)計專家 Design-Expert 8.0.5 b軟件中的Response Surface程序進(jìn)行響應(yīng)面實驗設(shè)計，應(yīng)用ANOVA程序進(jìn)行方差分析，應(yīng)用 Model Graph 程序作響應(yīng)曲面圖和等高線圖，應(yīng)用Optimization 程序中 Numerical 分析得預(yù)測最優(yōu)值.根據(jù)試驗取得的數(shù)據(jù)建立回歸方程：Y=∑A0+∑AiXi+∑AiiXii+∑AijXiXj，式中：Y(透光率)為響應(yīng)值；A0為常數(shù)項；Ai、Aii、Aij分別為一次項、平方項和交互項的回歸方程系數(shù)；Xi和Xj為自變量.

2 結(jié)果與分析

2.1 離心法澄清蜜柚汁試驗

由圖1可以看出，在室溫下離心處理前25 min內(nèi)，蜜柚的透光率隨著離心時間的增加而升高的趨勢較為明顯，可能由于懸浮物在離心力的作用下迅速沉降，隨著離心時間的延長，懸浮物沉降得越多，透光率越高.但離心時間超過25 min 時，3000 r/min、3500 r/min 和 4000 r/min 條件下透光率上升趨勢都不明顯；另外，相同的離心時間時，蜜柚在 4000 r/min 的轉(zhuǎn)速下，透光率較高.所以，離心澄清效果最佳條件為轉(zhuǎn)速4000 r/min離心25 min，透光率為87.0%.

2.2 自然澄清法澄清蜜柚汁試驗

在果汁置于密閉容器中，經(jīng)長時間靜置，使懸浮物沉淀.在靜置過程中，蛋白質(zhì)和多酚類物質(zhì)也可逐漸形成不溶性的沉淀，所以長時間靜置可以使果汁得到澄清.由圖2可知，當(dāng)蜜柚汁不進(jìn)行澄清時，透光率為30.8%.自然澄清時間在5 h之內(nèi)時，隨著靜置時間的延長，透光率變化不大，在1 h時，透光率為48.4%，但之后透光率增加不顯著.但綜合考慮，此法仍達(dá)不到所需要的果汁澄清度.

2.3 酶法澄清蜜柚汁試驗

2.3.1 果膠酶濃度對澄清效果的影響

果膠酶濃度對蜜柚汁澄清效果的影響如圖3所示.由圖3可以看出，在45 ℃下果膠酶澄清處理蜜柚汁30 min，果汁的透光率得到較大的提高，果膠酶濃度對蜜柚汁澄清效果有顯著影響.果膠酶濃度從0增加到200 U/mL時，果汁透光率出現(xiàn)峰值.當(dāng)果膠酶濃度超過200 U/mL時，隨著酶濃度的增加，果汁中的大部分果膠物質(zhì)已經(jīng)降解，果汁透光率逐漸趨于穩(wěn)定.因此，響應(yīng)面分析中果膠酶濃度因素水平分別選取100～300 U/mL.

2.3.2 酶解溫度對澄清效果的影響

圖4顯示的是在不同溫度下，200 U/mL果膠酶澄清處理蜜柚汁30 min的透光率.由圖4可見，當(dāng)溫度為 50 ℃時，蜜柚汁的澄清達(dá)到最高，當(dāng)溫度繼續(xù)升高，蜜柚汁的澄清度反而降低.這可能是由于溫度過高，果膠酶被鈍化而活性受抑制；同時過高溫度使少量的大分子沉淀物質(zhì)重新溶解到蜜柚汁中，因此透光率呈現(xiàn)下降趨勢.因此，響應(yīng)面分析中果膠酶作用溫度的因素水平選用45～55 ℃.

2.3.3 酶解時間對澄清效果的影響

由圖5可知，在50 ℃下200 U/mL果膠酶澄清處理蜜柚汁的前45 min，果汁的透光率隨時間的延長呈不斷上升趨勢；45 min后，果汁透光率的提高相對變緩.可能是因為隨著沉淀時間的延長，沉淀越來越緊實，體積變小，沉淀量不再增加，視為沉淀過程已經(jīng)結(jié)束.但若作用時間過短，果膠酶對果膠的分解不完全，影響澄清效果.因此，響應(yīng)面分析中果膠酶作用時間的因素水平選用30～60 min.

2.3.4 響應(yīng)面法組合設(shè)計及試驗結(jié)果

表1 Box?Behnken試驗因素和編碼水平表Tab1 FactorsandlevelsofBox?Behnkenexperimentaldesign因素Factor編碼水平Codinglevel-10+1A酶濃度Enzymeconcentration/(U·mL-1)100200300B溫度Incubationtemperature/℃455055C時間Incubationtime/min304560

1)根據(jù)單因素試驗結(jié)果，取酶濃度、溫度、時間 3 個因素作為響應(yīng)面中心組合設(shè)計的影響因子，確定出各因子的適宜水平，其試驗因素和編碼水平如表 1 所示.

2)酶解澄清試驗分析和回歸方程的建立.以蜜柚汁透光率為指標(biāo)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化實驗，采用 Design Expert 軟件[13-14]中Response Surface程序設(shè)計的試驗及優(yōu)化的17 組試驗結(jié)果見表2.利用Design Expert 軟件中ANOVA程序?qū)Ρ?2 試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析及回歸系數(shù)顯著性檢驗，結(jié)果見表3和表4.回歸方程的方差分析顯示，模型的“Prob>F”為0.0011，說明該模型高度顯著.決定系數(shù)R2=0.9473，說明僅有約不到6%的果汁透光率數(shù)據(jù)不能用該模型解釋，失擬項P值為0.0779，失擬不顯著，說明方程擬合充分，預(yù)測值與實驗值之間有較高的相關(guān)度，可以用該回歸方程代替真實實驗點結(jié)果進(jìn)行分析.

由表4可知，一元二次回歸方程為：Y=0.064A-0.05B-0.44C-0.100AB-0.13AC+0.3BC-0.69A2-0.52B2-0.69C2+ 97.46，方程中變量為編碼值.一次項除了C(時間)(P=0.0016)以外，A(酶濃度)(P=0.5009)、B(溫度)(P=0.588)都對結(jié)果無顯著影響；二次項中A2(P=0.0007)、B2(P=0.0037)、C2(P=0.0037)對結(jié)果有極顯著影響；交互項中BC(P=0.0469)交互作用顯著，其余交互項均不顯著，表明實驗因子對實驗響應(yīng)值不是簡單的線性關(guān)系，而是呈二次關(guān)系，且三因素之間存在交互作用.方程中各項系數(shù)絕對值大小直接反映各因數(shù)對響應(yīng)值的影響程度，系數(shù)的正、負(fù)反映影響的方向.依據(jù)系數(shù)估計值A(chǔ)=0.062、B= -0.050、C= -0.44，可知影響因子的主效應(yīng)順序為：C>A>B.

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計方案及結(jié)果

表3 回歸模型方差分析

變異來源Sourceofvariation平方和Sumofsquares自由度Degreesoffreedom均方MeansquareF值FvalueP值Pvalue模型Model7．80090．87013．970．0011殘差Residuals0．43070．062失擬Lackoffit0．34030．1104．960．0779誤差Error0．09240．023總和Sum8．24016R2=0．9473

表4 回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗

3)響應(yīng)面交互作用和回歸模型的優(yōu)化.通過Design-Expert 8.0.5 b 軟件中 Model Graph 程序作出響應(yīng)曲面圖和等高線圖，通過圖形可以直觀地展示響應(yīng)值與實驗參數(shù)水平之間的關(guān)系.等高線的形狀可以反映交互效應(yīng)的強弱，圓形表示兩個因素之間交互作用不顯著，橢圓形表示兩個因素交互作用顯著[15].通過觀察可以發(fā)現(xiàn)，果膠酶濃度與酶解溫度、酶解時間沒有顯著的交互作用，而酶解溫度與酶解時間有顯著的交互作用.圖6是以果膠酶濃度和酶解溫度為變量生產(chǎn)的響應(yīng)面圖，從圖6中可以看出，當(dāng)果膠酶處理時間為45 min時，隨著果膠酶濃度與果膠酶處理溫度的不斷增大，蜜柚果汁透光率呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，當(dāng)果膠酶濃度在200 U/mL、果膠酶處理溫度在50 ℃附近時，蜜柚果汁透光率有最大值.圖7是以果膠酶濃度和酶時間為變量生產(chǎn)的響應(yīng)面圖，從圖7中可以看出，當(dāng)果膠酶處理溫度為50 ℃時，隨著果膠酶濃度與果膠酶處理時間的不斷增大，蜜柚果汁透光率呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，當(dāng)果膠酶濃度在200 U/mL、果膠酶處理時間在45 min附近時，蜜柚果汁透光率有最大值.圖8所示2D圖形輪廓呈現(xiàn)橢圓形，結(jié)合分析結(jié)果中BC有較小的P值(0.046)，可見果膠酶處理溫度與果膠酶處理時間交互作用顯著，且當(dāng)果膠酶濃度在200 U/mL時，在果膠酶處理時間在45 min、果膠酶處理溫度50 ℃附近，蜜柚果汁透光率有最大值.

4)最佳工藝條件確定與驗證.根據(jù)Design-Expert 8.0.5 b軟件的 Optimization 程序中 Numerical 分析，可得到該模型的最大估計值為98.5%，參數(shù)的最佳水平是：A(酶濃度)為200 U/mL，B(溫度)為49 ℃，C(時間)為40 min.在上述參數(shù)最優(yōu)值的情況下，進(jìn)行驗證，試驗結(jié)果分別為97.2%、97.1%、97.5%、97.3%、97.3%、97.1%，平均實測值(97.2±0.15%)與預(yù)測值97.5%相近，相對誤差在2%以下，證明應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化果膠酶澄清蜜柚汁的關(guān)鍵因子是可行的，優(yōu)化模型有較好可靠性.

2.4 幾種澄清方法的比較

由圖9可知:比較離心澄清、自然澄清和果膠酶澄清法對蜜柚汁澄清效果，以果膠酶澄清效果最好，所需時間也最短，澄清40 min 透光率就已達(dá)到 97.2%，分別比離心澄清法和自然澄清法高10.3%、48.9%.比較離心澄清和自然澄清，二者澄清效果有顯著性差異，在轉(zhuǎn)速4000 r/min下離心25 min后透光率達(dá)到87.0%，明顯高于自然澄清的.

3 結(jié)論

1)果膠酶法澄清蜜柚汁效果明顯優(yōu)于離心澄清法和自然澄清法.在單因素實驗基礎(chǔ)上確定了果膠酶法響應(yīng)面試驗設(shè)計的因素水平為酶濃度100～300 U/mL、酶解溫度45～55 ℃、酶解時間30～60 min.

2)通過試驗結(jié)果的方差分析及回歸系數(shù)顯著性檢驗可知，果膠酶法澄清蜜柚汁條件優(yōu)化數(shù)學(xué)回歸模型為：Y=0.064A-0.05B-0.44C-0.100AB-0.13AC+0.3BC-0.69A2-0.52B2-0.69C2+97.46.采用此模型在本試驗范圍內(nèi)能較準(zhǔn)確地預(yù)測蜜柚汁的透光率.在本實驗范圍內(nèi)，各因素對果膠酶法澄清蜜柚汁的影響作用大小順序依次為：酶解時間>酶濃度>酶解溫度.

3)果膠酶法澄清蜜柚汁的最佳工藝參數(shù)為酶用量 200 U/mL、酶解溫度49 ℃和酶解時間44 min，在此條件下，理論透光率達(dá)到97.5%，而實際測得的蜜柚汁的透光率為97.2%，與理論預(yù)測值的相對誤差小于2%.實驗值與理論值是吻合的，證明了該模型是合理可靠的.

[1]宋慧，馬利華，陳學(xué)紅.響應(yīng)面優(yōu)化酶法澄清牛蒡汁工藝的研究 [J].食品工程，2011(10)：132-135.

[2]莊伊美，潘東明，李健，等.琯溪蜜柚果實?；Y矯治研究 [J].亞熱帶植物科學(xué)，2000，29(4)：1- 4.

[3]張怡.福建特產(chǎn)柚子加工及綜合利用技術(shù)的研究 [D].福州：福建農(nóng)林大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，2009.

[4]BERMEJO A，CANO A.Analysis of nutritional constituents in twenty citrus cultivars from the mediterranean area at different stage of ripening [J].Food and Nutrition Sciences，2012(3)：639-650.

[5]RAMFUL D，TARNUS E，ARUOMA O I，et al.Polyphenol composition，vitamin C and antioxidant capacity of Mauritian citrus fruit pulps [J].Food Research International，2011，44(7)：2088-2099.

[6]蔡坤秀.漳州市平和縣琯溪蜜柚產(chǎn)業(yè)化發(fā)展研究 [D].福州：福建農(nóng)林大學(xué)作物科學(xué)學(xué)院，2011.

[7]BAKER R A，CAMERON R G.Clouds of citrus juices and juice drinks [J].Food Technology，1999(53)：64-69.

[8]WALL K M,TAIT V M,EASTWELL K C,et al.Haze development in aerobically or anaerobically produced clarified apple juices[J].Journal of Food Science,1996,61(1):92-96.

[9]趙曉佳.澄清型酥梨宣木瓜復(fù)合果汁加工工藝及穩(wěn)定性研究 [D].合肥：安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)茶與食品科技學(xué)院，2012.

[10]陳永浩.歐李澄清汁加工工藝研究 [D].保定：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)學(xué)院，2006.

[11]王飛.黑加侖果汁穩(wěn)定性的研究 [D].哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，2007.

[12]ALKIRA ENDO.Mechanism of enzymatic clarification of apple juice [J].Agricultural Biological Chemistry，1965,29(3)：229-238.

[13]張軍偉，傅大放，彭奇均，等.響應(yīng)面法優(yōu)化酸水解稻稈制木糖的工藝參數(shù) [J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報， 2009，25(11)：253-257.

[14]陳源，楊道富，范麗華，等.響應(yīng)面法優(yōu)化微波提取茂谷橘橙皮總黃酮工藝 [J].中國食品學(xué)報，2013，13(4)：80-86.

[15]趙思明.食品科學(xué)與工程中計算機(jī)的應(yīng)用 [M].北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2005：38- 46.

(責(zé)任編輯 馬建華 英文審校 曹敏杰)

Optimization of Enzymatic Clarification of Guanxi Pomelo Juice Using Response Surface Methodology

XU Jian1，CAI Hui-nong1,2,3，NI Hui1,2,3，DU Xi-ping1,2,3，HUANG Gao-ling1,2,3

(1.College of Biological Engineering，Jimei University，Xiamen 361021，China;2.Research Center of Food Microbiology and Enzyme Engineering Technology，Jimei University，F(xiàn)ujian Province University，Xiamen 361021，China;3.Research Center of Food Biotechnology of Xiamen City，Xiamen 361021，China)

To optimize the process for clarifying Guanxi pomelo juice，a series of single-factor experiments were made to investigate the effects of enzyme concentration，incubation time，incubation temperature on the clarity of the product.Based on single-factor experiments，a 17-run response surface design involving 3 factors at 3 levels was generated by the Design-Expert software according to the Box-Behnken design principle and experimental data thus obtained were subjected to quadratic regression analysis to create a mathematical model for clarification.The optimal enzyme clarification condition was using 200 U/mL of enzyme,and react at 49 ℃ for 40 min.Under these conditions，the clarity of pomelo juice reached 97.2%.This was similar to the estimated value of 97.5%.

Guanxi pomelo juice；enzymatic clarification;optimization；response surface methodology

2013-09-26

2013-11-05 [基金項目]國家自然科學(xué)基金資助項目(31371751)；福建省自然科學(xué)基金資助項目(2011J01225)；福建省教育廳項目(JA12188)；廈門市杰出青年人才基金項目(3502Z20126008)；集美大學(xué)科研創(chuàng)新團(tuán)隊基金資助項目(2010A006)

許鍵(1988—)，男，碩士生，主要從事食品化學(xué)方向研究.通訊作者：黃高凌(1966—)，女，副教授，從事食品化學(xué)方向研究，E-mail:hgaol@jmu.edu.cn.

1007-7405(2014)02-0100-07

TS 255.44

A