卵巢上皮性癌中p-AKT、PI3K和PTEN蛋白的表達(dá)及意義

程佳 楊曉龍 尋志杰 張彩英 司華鵬 彭志美 于華 霍艷

·論著·

卵巢上皮性癌中p-AKT、PI3K和PTEN蛋白的表達(dá)及意義

程佳 楊曉龍 尋志杰 張彩英 司華鵬 彭志美 于華 霍艷

目的探討磷酸化AKT(p-AKT)、3-羧基磷脂酰肌醇激酶(PI3K)與張力蛋白同源的第10染色體丟失的磷酸酶基因(PTEN)在卵巢上皮性癌中的表達(dá)，分析它們之間的關(guān)系及其與卵巢上皮性癌患者預(yù)后的關(guān)系。方法應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法，檢測(cè)10例正常卵巢組織，20例卵巢良性上皮性腫瘤，60例卵巢上皮性癌組織中p-AKT、PI3K和PTEN的表達(dá)。結(jié)果P-AKT和PI3K在正常卵巢組織、卵巢良性上皮性腫瘤中的陽性表達(dá)顯著低于卵巢上皮性癌組織，而PTEN蛋白在卵巢上皮性癌組織中的表達(dá)顯著低于正常卵巢組織、良性上皮性腫瘤(P均<0.01)。P-AKT、PI3K和PTEN表達(dá)與臨床分期、病理分級(jí)、是否存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.01)，與年齡、病理類型及是否伴有腹水無關(guān)(P>0.05)。P-AKT和PI3K在卵巢上皮性癌中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.552，P<0.01)，P-AKT和PTEN卵巢上皮性癌中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.497，P<0.01)，PI3K和PTEN卵巢上皮性癌中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.535，P<0.01)。結(jié)論P(yáng)-AKT、PI3K的過表達(dá)伴隨PTEN表達(dá)缺失參與卵巢上皮性癌的發(fā)生發(fā)展。

卵巢腫瘤；AKT；PTEN；PI3K；免疫組織化學(xué)

卵巢癌的發(fā)病率在女性生殖器官惡性腫瘤中位居第三位，但其致死率卻占婦科腫瘤的首位，至今對(duì)于卵巢癌的發(fā)生機(jī)制仍不完全清楚。近年來信號(hào)傳導(dǎo)通路與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、治療及轉(zhuǎn)歸中的作用已經(jīng)成為研究的熱點(diǎn)。3羧基磷脂酰肌醇激酶(PI3K)/蛋白激酶B(AKT)信號(hào)傳導(dǎo)通路參與細(xì)胞生長、增殖、分化調(diào)節(jié)，與多種腫瘤細(xì)胞的惡性行為有關(guān)[1]。PTEN(phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10,PTEN)全稱是與張力蛋白同源在10號(hào)染色體有缺失的磷酸酶基因。磷酸化和去磷酸化是調(diào)節(jié)細(xì)胞活動(dòng)的重要方式，許多癌基因的產(chǎn)物都是通過磷酸化而刺激細(xì)胞生長。PTEN可能通過去磷酸化參與細(xì)胞調(diào)控。PTEN通過抑制PI3K/AKT通路，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。本研究應(yīng)用免疫組化方法探討p-AKT、PI3K與PTEN在卵巢上皮性癌組織中的表達(dá)，分析它們之間的關(guān)系及其與卵巢上皮性癌患者預(yù)后的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2008年10月至2010年12月邯鄲市第一醫(yī)院住院患者存檔的90份蠟塊，包括正常卵巢組織10份(正常組)，卵巢良性上皮腫瘤組織20份(良性組)，卵巢上皮癌組織60份(卵巢癌組)。正常組患者年齡22～58歲，中位年齡40歲；良性組患者年齡20～50歲，中位年齡35歲；卵巢癌組年齡35～75歲，中位年齡55歲。3組年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。卵巢癌病理分級(jí)：G1 18例，G2 15例，G3 27例；按國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO，1988年)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行手術(shù)病理分期：Ⅰ、Ⅱ期22例，Ⅲ、Ⅳ期38例。

1.2 主要試劑 兔抗人p-AKT多克隆抗體，兔抗人PI3K多克隆抗體，購自Cell Signaling Technology公司。兔抗人PTEN多克隆抗體，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。DAB顯色劑、過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素標(biāo)記盒(SP)試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 染色方法及結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) 通過免疫組化鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連接法對(duì)p-AKT、PI3K、PTEN蛋白的表達(dá)進(jìn)行觀察。染色設(shè)陰性及陽性對(duì)照。陰性對(duì)照使用磷酸鹽緩沖液代替一抗，取p-AKT、PI3K、PTEN表達(dá)陽性的乳腺癌組織的石蠟切片作為陽性對(duì)照。結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)：(1)據(jù)陽性細(xì)胞比例：光學(xué)顯微鏡下選取5個(gè)視野，每個(gè)視野隨機(jī)選取100個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的比例作為陽性細(xì)胞比例，取平均值。①陽性細(xì)胞≤10%評(píng)1分；②陽性細(xì)胞為10%～50%評(píng)2分；③陽性細(xì)胞為51%～74%評(píng)3分；④陽性細(xì)胞≥75%評(píng)4分。(2)據(jù)陽性細(xì)胞染色強(qiáng)度：細(xì)胞不顯色為0分；淺黃色為1分；棕黃色為2分；黃褐色為3分。陽性細(xì)胞比例乘以細(xì)胞染色強(qiáng)度積分為每例標(biāo)本得分，范圍為0～12分，其中0分為(-)，1～4分(﹢)，5～8分為(﹢﹢)，9～12分為(﹢﹢﹢)。陽性表達(dá)率的計(jì)算方法為陽性表達(dá)細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù)×100%。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)，相關(guān)性應(yīng)用Spearman等級(jí)相關(guān)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 p-AKT、PI3K和PTEN在卵巢組織中的表達(dá) 卵巢上皮癌組織中p-AKT和PI3K的陽性表達(dá)率顯著高于卵巢正常組織和良性組織(P<0.05)，卵巢正常組織與卵巢良性組織間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。卵巢上皮癌組織中PTEN的陽性表達(dá)率顯著低于卵巢正常組織和良性組織(P<0.05)，卵巢正常組織與卵巢良性組織間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 正常卵巢、卵巢良性腫瘤和上皮性卵巢癌中p-AKT、PI3K和PTEN的表達(dá) 例(%)

注：與卵巢癌組比較,*P<0.01

2.2 p-AKT、PI3K和PTEN蛋白與卵巢癌臨床參數(shù)的關(guān)系 p-AKT、PI3K和PTEN的表達(dá)與卵巢上皮癌手術(shù)病理分期、病理分級(jí)有關(guān) (P<0.05)，而與年齡、病理類型無關(guān)(P>0.05)。見表2。

表2 p-AKT、PI3K和PTEN蛋白與卵巢癌臨床參數(shù)的關(guān)系

2.3 卵巢癌中p-AKT、PI3K和PTEN蛋白表達(dá)的關(guān)系 p-AKT和PI3K在上皮性卵巢癌中的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.552，P<0.01)，p-AKT和PTEN上皮性卵巢癌中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.497，P<0.01)，PI3K和PTEN上皮性卵巢癌中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.535，P<0.01)。見表3。

表3 卵巢癌中p-AKT、PI3K和PTEN蛋白表達(dá)的關(guān)系 例

3 討論

PI3K的擴(kuò)增、AKT的過度活化，或PI3K/AKT的某些調(diào)控成分如PTEN的功能缺失，可使PI3K/AKT通路的調(diào)節(jié)失調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、侵襲、轉(zhuǎn)移及化療耐藥。PI3K屬于原癌基因，它是連接細(xì)胞外信號(hào)和細(xì)胞內(nèi)應(yīng)答的重要分子，在一系列信號(hào)分子的影響下，對(duì)細(xì)胞凋亡起重要作用。AKT屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶，是一種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白。AKT表達(dá)水平增高后可以保護(hù)細(xì)胞免受凋亡，進(jìn)而促進(jìn)細(xì)胞生長[2]。AKT是PI3K下游的靶蛋白，PI3K活化的產(chǎn)物是AKT活化所必需的。PI3K活化的產(chǎn)物為磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸(PIP2)和磷脂酰肌醇-3,4,5-三磷酸(PIP3)，它們可以使AKT的構(gòu)象發(fā)生改變，導(dǎo)致AKT由細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)至細(xì)胞膜，通過一系列的級(jí)聯(lián)反應(yīng)使AKT發(fā)生活化，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生、發(fā)展[3]。有研究表明PI3K和AKT的過度表達(dá)在卵巢癌中普遍存在，導(dǎo)致細(xì)胞延遲死亡[4]，進(jìn)而促進(jìn)卵巢癌的發(fā)生。因此，p-AKT可能是卵巢癌發(fā)生、發(fā)展過程中的重要因素，并與卵巢癌的轉(zhuǎn)歸及預(yù)后密切相關(guān)。PTEN是腫瘤抑制基因，人體幾乎所有組織都含這種蛋白質(zhì)。它通過阻止細(xì)胞生長、分裂的速度過快或者分裂不受控制的方式，調(diào)控細(xì)胞分裂周期。PTEN蛋白可以通過去除磷酸基進(jìn)而修飾其他蛋白質(zhì)和脂肪。有報(bào)道PTEN突變后細(xì)胞內(nèi)PIP3含量增高，使細(xì)胞重新表達(dá)PTEN后細(xì)胞內(nèi)PIP3開始下降，說明PTEN是以PIP3為底物的磷酸酶，它使PIP3的3’位脫磷酸，從而形成PIP2，喪失PIP3的信使功能，成為拮抗PI3K、下調(diào)AKT通路的重要調(diào)節(jié)基因。因此，PTEN常被稱為PI3K/AKT信號(hào)通路的“開關(guān)”。國外亦可見PTEN通過抑制PI3K/AKT通路抑制腫瘤發(fā)生發(fā)展的報(bào)道，包括卵巢癌[5]，黑色素瘤，胃癌，膠質(zhì)瘤等[6，7]。

本研究發(fā)現(xiàn)，p-AKT及PI3K在卵巢組織中呈現(xiàn)高表達(dá)，而在正常卵巢組織中表達(dá)很弱。正常組及良性組的表達(dá)顯著低于卵巢癌組(P<0.05)，提示p-AKT和PI3K可能對(duì)于卵巢癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后起重要作用。隨著卵巢癌的臨床期別上升，腫瘤細(xì)胞的分化程度下降，p-AKT和PI3K的陽性表達(dá)率越高。有研究發(fā)現(xiàn)從正常卵巢上皮細(xì)胞到不典型增生再到卵巢癌的轉(zhuǎn)化過程中，p-AKT和PI3K的表達(dá)水平不斷增高，并可伴隨腫瘤抑制基因的失調(diào)節(jié)，從而喪失腫瘤抑制基因抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用，是p-AKT和PI3K提高卵巢腫瘤細(xì)胞生存能力的證據(jù)[8]。

本實(shí)驗(yàn)表明正常卵巢組織中PTEN的陽性表達(dá)率明顯高于卵巢上皮性癌組織，隨著PTEN的陽性表達(dá)率顯著下降，其抑制腫瘤細(xì)胞生長及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡和能力逐漸減弱，無法使PTEN編碼的產(chǎn)物PIP3在D3位去磷酸化生成PIP2，從而喪失了對(duì)P13K/Akt信號(hào)通路的負(fù)性調(diào)節(jié)。因此，PTEN的表達(dá)缺失促進(jìn)了卵巢癌的發(fā)生。正常組、良性組中PTEN的陽性表達(dá)與卵巢癌組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而良性組與正常組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，反映了PTEN對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖的抑制程度。

PTEN的表達(dá)水平與AKT的磷酸化水平呈負(fù)相關(guān)，且患者的生存期與PTEN的表達(dá)水平呈正相關(guān)、與AKT的磷酸化水平呈負(fù)相關(guān)。PTEN的表達(dá)水平隨著卵巢癌病理分級(jí)及臨床分期的升高而下降，卵巢癌細(xì)胞分化程度與PTEN的陽性表達(dá)率呈正相關(guān)。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)PTEN可以抑制卵巢癌細(xì)胞的生長、促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的凋亡、提高卵巢癌細(xì)胞對(duì)抗癌基因的敏感性[9]，并與化療耐藥有關(guān)[10]。因此，PTEN蛋白可能是評(píng)價(jià)卵巢癌惡性生物學(xué)行為的重要參考指標(biāo)，并可能會(huì)成為卵巢癌早期診斷和評(píng)價(jià)預(yù)后的重要分子標(biāo)志物。因此以PI3K/AKT通路為靶點(diǎn)的小分子藥物將有望對(duì)卵巢癌的治療起到非常重要的作用，并為解決化療耐藥問題提供新思路。

1 郭瑞霞，魏麗惠.磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號(hào)傳導(dǎo)通路與婦科惡性腫瘤的研究進(jìn)展.中華婦產(chǎn)科雜志，2005，40：358-360.

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9 Wu R,Hendrix-Lucas N,Kuick R,et al.Mouse Model of Human Ovarian Endometrioid Adenocarcinoma Based on Somatic Defects in the Wnt/beta-Catenin and PI3K/Pten Signaling Pathways.Cancer Cell，2007,11:321-333.

10 Pandey SK,He HJ,Chesley A,et al.Wortmannin-sensitive pathway is required for insulin-stimulated phosphorylation of inhibitor kappa Balpha.Endocrinology,2002,143:375-385.

ExpressionandsignificanceofphosphorylatedproteinkinaseB,PI3KandPTENproteininovarianepithelialcancer

CHENGJia*,YANGXiaolong,XUNZhijie*,etal.*TheFirstHospitalofHandanCity,Hebei,Handan056002,China

ObjectiveTo analyze the expression and significance of phosphorylated protein kinase B (p-AKT),PI3K and PTEN protein in ovarian epithelial cancers and to investigate the correlation among them and the correlation between their expression and prognosis of patients with ovarian epithelial cancer.MethodsThe positive expression rates of p-AKT,PI3K and PTEN were detected by immunohistochemical method in 10 cases of normal ovarian tissues,20 cases of ovary benign epithelial tumors and 60 cases of ovarian epithelial cancers.ResultsThe positive expression rates of p-AKT and PI3K in normal ovarian tissues and ovary benign epithelial tumors were significantly lower than those in ovarian epithelial cancers,however,the positive expression rates of PTEN in ovarian epithelial tissues were significantly lower than those in normal ovarian tissues and ovary benign epithelial tumors (P<0.01).The expression levels of p-AKT,PI3K and PTEN were closely correlated to clinical stage,differentiation degree of cancer cells,pathological classification and lymph node metastasis (P<0.01),however,which were not related to patient's age,histological type and ascites (P>0.05).The expression of p-AKT was positively related to that of PI3K in ovarian epithelial cancer (r=0.552,P<0.01),however,the expression of p-AKT was negatively related to that of PTEN in ovarian epithelial cancer (r=-0.497,P<0.01),and the expression of PI3K was negatively correlated to that of PTEN in ovarian epithelial cancer (r=-0.535,P<0.01).ConclusionThe overexpression of p-AKT and PI3K followed by absence of PTEN are involved in the pathogenesis and development of ovarian epithelial cancer.

ovarian cancer; AKT; PTEN; PI3K;immunohistochemistry

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.04.006

056002 河北省邯鄲市第一醫(yī)院(程佳、尋志杰、張彩英、司華鵬、彭志美、于華、霍艷)；河北省邯鄲市中心醫(yī)院(楊曉龍)

R 737.31

A

1002-7386(2014)04-0501-04

2013-08-11)