MMP-9和咬合蛋白在彌漫性腦損傷大鼠皮層的表達(dá)變化及與腦水腫的關(guān)系

趙軼群 王麗娜 劉永亮 王鵬

·論著·

MMP-9和咬合蛋白在彌漫性腦損傷大鼠皮層的表達(dá)變化及與腦水腫的關(guān)系

趙軼群 王麗娜 劉永亮 王鵬

目的觀察彌漫性腦損傷大鼠腦水腫及損傷區(qū)皮層MMP-9和咬合蛋白表達(dá)的變化。方法成年健康SD雄性大鼠160只,按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組(n=60)和模型組(n=100)。應(yīng)用Marmarou’s法建立彌漫性腦損傷大鼠模型。2組分別于術(shù)后3、12、24、72、144 h行干濕重法檢測(cè)2組大鼠腦組織含水量變化，行免疫組化和Western blot檢測(cè)損傷區(qū)周圍皮層MMP-9和咬合蛋白表達(dá)水平。對(duì)各結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果與對(duì)照組比較，模型組各時(shí)間點(diǎn)大鼠腦組織含水量明顯增加，腦組織損傷區(qū)周圍皮層MMP-9表達(dá)明顯增高(P<0.05)，咬合蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。腦組織含水量變化與MMP-9表達(dá)變化呈正相關(guān)(P<0.05)，腦組織含水量變化與咬合蛋白表達(dá)變化呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)，MMP-9蛋白表達(dá)變化與咬合蛋白表達(dá)變化呈負(fù)相關(guān)(P<0.05)。結(jié)論彌漫性腦損傷發(fā)生后損傷區(qū)皮層MMP-9蛋白表達(dá)明顯增加，咬合蛋白表達(dá)明顯降低，腦水腫形成。MMP-9表達(dá)的增加，導(dǎo)致了咬合蛋白破壞，腦水腫形成。

彌漫性腦損傷；腦水腫；基質(zhì)金屬蛋白酶-9；咬合蛋白

腦水腫是顱腦創(chuàng)傷發(fā)生后主要的病理生理過(guò)程之一，可引起顱內(nèi)壓增高，明顯加重顱腦創(chuàng)傷的病理?yè)p害?；|(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinase-9，MMP-9)是一種Zn2+依賴性蛋白酶，可攻擊腦血管外基膜的層黏蛋白和纖粘蛋白，破壞血腦屏障，與腦水腫形成密切相關(guān)。咬合蛋白是腦微血管緊密連接的主要組成部分之一。有關(guān)彌漫性腦創(chuàng)傷大鼠腦水腫和皮層MMP-9、咬合蛋白表達(dá)之間的關(guān)系尚未見(jiàn)臨床報(bào)道。本研究采用Marmarou’s[1]法制造彌漫性腦創(chuàng)傷大鼠模型，觀察MMP-9和咬合蛋白表達(dá)變化與腦水腫形成之間的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組 成年SD雄性大鼠160只，清潔級(jí),平均體重(300±20)g，購(gòu)自北京維通利華公司(合格證：SCXK(京)2002-003)，于河北聯(lián)合大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，在常溫下常規(guī)飼料喂養(yǎng)。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)遵循國(guó)際生命指導(dǎo)中心關(guān)心和使用動(dòng)物實(shí)驗(yàn)原則。按隨機(jī)數(shù)字表法分為對(duì)照組(n=60)和模型組(n=100)。

1.2 模型制備 參考Marmamu法[1]制作大鼠彌漫性腦創(chuàng)傷模型：乙醚麻醉動(dòng)物(麻醉時(shí)間約為70～150 s)，將麻醉好的大鼠俯臥位固定于海面床墊(10 cm×20 cm×30 cm)上，將質(zhì)量450 g、直徑18 mm的銅棒自1.5 m高度垂直落下撞擊置于大鼠冠狀縫與失狀縫正中的不銹鋼墊，造成大鼠彌漫性顱腦創(chuàng)傷模型。正常對(duì)照組動(dòng)物只進(jìn)行乙醚麻醉而不致傷。在模型制作過(guò)程中死亡32只，給予補(bǔ)充。

1.3 腦組織含水量測(cè)定 隨機(jī)選取2組各時(shí)間點(diǎn)大鼠各5只，以10%水合氯醛麻醉，斷頭處死，開顱取腦，從損傷區(qū)周圍取200 mg左右的腦組織，采用MA110電子分析天平(上海第二天平儀器廠)稱濕重并記錄后置于105℃恒溫干燥箱內(nèi)干燥48 h至恒重，稱干重后按Elliot公式計(jì)算腦含水量：腦含水量=(濕重-干重)/濕重×100%。

1.4 免疫組化檢測(cè)腦損傷周圍皮層MMP-9和咬合蛋白表達(dá)變化 隨機(jī)選取2組各時(shí)間點(diǎn)大鼠各5只，10%水合氯醛深度麻醉后開胸,4%多聚甲醛灌注,斷頭取腦,置于4%多聚甲醛液中4℃冰箱過(guò)夜至組織塊沉底。冠狀切取2 mm厚包含損傷區(qū)域及左右半球的組織塊浸于4%多聚甲醛中再固定4 h。經(jīng)自來(lái)水沖洗48 h，常規(guī)梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋。將石蠟包埋的組織塊取出放入切片機(jī)中做連續(xù)切片,片厚5 μm。

取各大鼠等部位切片3張，經(jīng)二甲苯二級(jí)脫蠟各5 min，梯度乙醇脫水，3%H2O2溶液室溫10 min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，高壓熱修復(fù)，后滴加1∶100比例稀釋的咬合蛋白一抗(武漢博士德生物工程有限公司)4℃過(guò)夜，次晨取出置常溫，PBS緩沖液沖洗后，滴加二抗，37℃孵育1 h，DAB顯色，水沖洗后蘇木素復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封片。光鏡下觀察細(xì)胞核呈藍(lán)色，陽(yáng)性細(xì)胞腫脹，包漿黃染。在400×顯微鏡下在傷灶周圍隨機(jī)選取5個(gè)視野，用美國(guó)Media Cybernetics公司生產(chǎn)的Image-Pro-Plus圖像分析系統(tǒng)照相后計(jì)算每個(gè)視野中陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目。

1.5 Western blot 檢測(cè)腦損傷周圍皮層MMP-9和咬合蛋白表達(dá)變化 用細(xì)胞裂解液提取各組各時(shí)間點(diǎn)大鼠損傷區(qū)周圍腦組織總蛋白，運(yùn)用考馬斯亮藍(lán)比色法測(cè)定各個(gè)樣本蛋白含量，上樣量為100 μg蛋白。進(jìn)行15%SDS-PAGE凝膠電泳，NC轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉；山羊抗MMP-9多克隆一抗(1∶1 000稀釋)、山羊抗咬合蛋白(rI’11r18/serl9)多克隆一抗(1∶1 000稀釋) 、山羊抗actin多克隆一抗(1∶1 000稀釋)，4℃過(guò)夜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗(1∶1 000稀釋)進(jìn)行雜交。EcL發(fā)光劑3 min，曝光、顯影、定影。采用數(shù)碼成像分析系統(tǒng)軟件分析Westem blot結(jié)果平均灰度值，以目標(biāo)的平均灰度值比內(nèi)參的平均灰度值比值的大小作為分析對(duì)象進(jìn)行比較。

1.6 相關(guān)性分析 采用線性相關(guān)分析法分別對(duì)腦組織含水量變化與MMP-9免疫組化結(jié)果、腦組織含水量與咬合蛋白免疫組化結(jié)果、腦組織含水量與MMP-9 Western blot結(jié)果、腦組織含水量與咬合蛋白Western blot結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果

2.1 腦組織含水量測(cè)定 對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)腦組織含水量無(wú)明顯差異。與對(duì)照組比較，模型組大鼠腦組織含水量明顯增高(P<0.05)。其中3 h腦組織含水量開始增加，12 h繼續(xù)增加，24 h達(dá)到高峰，72 h腦組織含水量開始降低，144 h腦組織含水量明顯降低。見(jiàn)表1。

組別3h12h24h72h144h對(duì)照組71．67±0．2771．76±0．2271．70±0．2671．81±0．0971．73±0．28模型組74．16±0．2375．54±0．2479．30±0．2778．05±0．2573．10±0．17F值246．23660．972068．872744．3785．86P值0．000．000．000．000．00

2.2 MMP-9免疫組合結(jié)果 對(duì)照組可見(jiàn)一定量被染成棕黃色的陽(yáng)性細(xì)胞，胞膜表達(dá)，各時(shí)間點(diǎn)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯差異(P>0.05)。與對(duì)照組比較，模型組大鼠損傷區(qū)周圍陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯增多(P<0.05)。其中傷后3 h MMP-9陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)即開始增多，24 h達(dá)到高峰，72 h開始減少，144 h明顯減少。見(jiàn)表2。

組別3h12h24h72h144h對(duì)照組19．4±2．319．6±2．720．2±4．021．0±2．820．0±2．4模型組28．6±2．755．4±3．2111．8±3．075．8±2．927．4±3．2F值33．59364．101719．38926．8617．33P值0．000．000．000．000．00

2.3 咬合蛋白免疫組化結(jié)果 對(duì)照組可見(jiàn)一定量被染成棕黃色的陽(yáng)性細(xì)胞，細(xì)胞核表達(dá)，各時(shí)間點(diǎn)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯差異。與對(duì)照組比較，模型組大鼠損傷區(qū)周圍陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)明顯減少(P<0.05)。其中傷后3 h咬合蛋白陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)開始減少，24 h減少最明顯，72 h開始增加，144 h明顯增加。見(jiàn)表3。

組別6h12h24h72h144h對(duì)照組38．4±1．538．2±1．938．6±1．738．8±0．438．2±0．8模型組29．8±0．417．2±2．610．0±2．615．6±1．130．8±3．0F值147．92212．02417．33326．2129．13P值0．000．000．000．000．00

2.4 MMP-9 western blot結(jié)果 對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)蛋白含量無(wú)明顯差異。與對(duì)照組比較，模型組大鼠損傷區(qū)腦組織咬合蛋白含量明顯增加(P<0.05)。其中傷后3 h咬合蛋白含量開始減少，24 h減少最明顯，72 h開始增加，144 h明顯增加。見(jiàn)表4，圖1。

組別3h12h24h72h144h對(duì)照組0．175±0．0090．172±0．0090．173±0．0090．175±0．0090．177±0．007模型組0．290±0．0110．480±0．0090．775±0．0060．654±0．0050．346±0．005F值323．083088．2414986．6511733．221894．14P值0．000．000．000．000．00

2.5 咬合蛋白 Western blot 結(jié)果 對(duì)照組各時(shí)間點(diǎn)蛋白含量無(wú)明顯差異。與對(duì)照組比較，模型組大鼠損傷區(qū)腦組織咬合蛋白含量明顯增加(P<0.05)。其中傷后3 h咬合蛋白含量開始減少，24 h減少最明顯，72 h開始增加，144 h明顯增加。見(jiàn)表5，圖1。

組別6h12h24h72h144h對(duì)照組2．2544±0．00772．2560±0．00842．2550±0．00702．2551±0．00812．2555±0．0092模型組1．8687±0．00711．7034±0．00691．4626±0．00811．6450±0．00611．9703±0．0061F值6790．9812760．7627501．8018175．213320．80P值0．000．000．000．000．00

1A：MMP-9在對(duì)照組各時(shí)相點(diǎn)的表達(dá)，其在各時(shí)相點(diǎn)的表達(dá)無(wú)明顯差異；1B：MMP-9在模型組各時(shí)相點(diǎn)的表達(dá)，其在造模成功后3 h(第1個(gè)條帶)開始增加，24 h(第3個(gè)條帶)達(dá)高峰，72 h開始減少(第4個(gè)條帶)，144 h(第5個(gè)條帶)明顯減少；1C：occludin在對(duì)照組各時(shí)相點(diǎn)的表達(dá)，其在各時(shí)相點(diǎn)的表達(dá)無(wú)明顯差異；1D：occludin在模型組各時(shí)相點(diǎn)的表達(dá)，其在造模成功后3 h(第1個(gè)條帶)開始減少，24 h(第3個(gè)條帶)減少最明顯，72 h開始恢復(fù)(第4個(gè)條帶)，144 h(第5個(gè)條帶)明顯恢復(fù)；1E：內(nèi)參，內(nèi)參在各組各時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)無(wú)變化。

圖4 損傷周圍腦組織咬合蛋白表達(dá)

2.6 相關(guān)性分析結(jié)果 (1)傷后各時(shí)間點(diǎn)腦組織含水量變化與MMP-9免疫組化結(jié)果呈正相關(guān)(r=0.962，P<0.05)。(2)傷后各時(shí)間點(diǎn)腦組織含水量變化與咬合蛋白免疫組化結(jié)果呈負(fù)相關(guān)(r=-0.904，P<0.05)。(3)傷后各時(shí)間點(diǎn)腦組織含水量變化與MMP-9 Western blot結(jié)果呈正相關(guān)(r=0.904，P<0.05)。(4)傷后各時(shí)間點(diǎn)腦組織含水量變化與咬合蛋白Western blot結(jié)果呈負(fù)相關(guān)(r=-0.966，P<0.05)。(5)傷后各時(shí)間點(diǎn)MMP-9免疫組化結(jié)果與咬合蛋白免疫組化結(jié)果呈負(fù)相關(guān)(r=-0.915，P<0.05)。(6)傷后各時(shí)間點(diǎn)MMP-9 Western blot結(jié)果與咬合蛋白Western blot結(jié)果呈負(fù)相關(guān)(r=-0.940，P<0.05)。

3 討論

腦水腫是顱腦創(chuàng)傷發(fā)生后的主要繼發(fā)性病理過(guò)程。本研究應(yīng)用干濕重法檢測(cè)彌漫性腦創(chuàng)傷大鼠腦組織含水量的變化提示傷后3 h腦水腫即開始形成，24 h達(dá)到高峰，72 h開始緩解，144 h腦水腫明顯緩解，與以往學(xué)者研究結(jié)果大致相符。有關(guān)腦創(chuàng)傷后腦水腫的形成機(jī)制包括腦出血、微循環(huán)障礙、炎癥反應(yīng)、自由基損傷、鈣超載、血腦屏障破壞等[2]。而有關(guān)MMP-9和咬合蛋白對(duì)腦創(chuàng)傷后腦水腫的影響尚未見(jiàn)臨床報(bào)道。

基質(zhì)金屬蛋白酶是一組調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)成分的Zn2+依賴性重要蛋白酶。MMP-9是基質(zhì)金屬蛋白酶的一類，主要存在于腦組織的海馬、皮質(zhì)和紋狀體中，但正常情況下含量很少[3]。正常情況下，MMP-9以酶原的形式存在，MMP-9酶原被激活后迅速被降解，以防其過(guò)度活化[4]。本研究采用免疫組化和Western blot檢測(cè)腦創(chuàng)傷大鼠皮層MMP-9蛋白表達(dá)的變化提示傷后3 h損傷區(qū)皮層MMP-9表達(dá)即開始增加，24 h達(dá)高峰，72 h開始降低，144 h MMP-9表達(dá)量明顯降低。相關(guān)性分析提示傷后腦水腫變化與MMP-9表達(dá)變化呈正相關(guān)，提示MMP-9參與了腦水腫的形成。Gidday等[5]發(fā)現(xiàn)白細(xì)胞，特別是中性粒細(xì)胞是腦梗死后MMP-9的來(lái)源。而MMPs的基因表達(dá)受以下三方面的調(diào)控：(1)MMPs基因表達(dá)受細(xì)胞因子(IL-1、IL-6等)、生長(zhǎng)因子(VEGF、FGF)、蛋白激酶、糖皮質(zhì)激素等調(diào)控；(2)MMP-9酶原需要被MMP-3、纖溶酶及纖溶酶原激活物、NO等激活為有活性的MMP-9[6]；(3)血漿中的α2巨球蛋白能抑制MMP-9的活性。所以我們認(rèn)為當(dāng)腦創(chuàng)傷發(fā)生時(shí)可繼發(fā)炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致中性粒細(xì)胞數(shù)目增高，MMP-9產(chǎn)生增多。此外顱腦創(chuàng)傷后炎性因子TNF、IL-1、IL-6等表達(dá)增加，進(jìn)而激活MMP-9，發(fā)揮其生物學(xué)活性，導(dǎo)致腦水腫的形成。

咬合蛋白是腦微血管緊密連接的主要成分，與腦水腫形成的關(guān)系密切。本研究應(yīng)用免疫組化和Western blot對(duì)大鼠腦創(chuàng)傷后皮層咬合蛋白的表達(dá)進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)：彌漫性腦損傷后3 h咬合蛋白表達(dá)開始減少，24 h減少最明顯，72 h后開始增加，144 h后損傷區(qū)咬合蛋白含量明顯增加。相關(guān)性分析結(jié)果提示腦水腫與皮層咬合蛋白表達(dá)變化呈負(fù)相關(guān),且為顯著相關(guān)。提示咬合蛋白的破壞與腦水腫的形成密切相關(guān)。Yu等[7]研究表明，當(dāng)咬合蛋白表達(dá)下降時(shí)，緊密連接功能受損，對(duì)離子的通透性增加，證明咬合蛋白對(duì)維持緊密連接的正常功能有非常重要的作用。MMP-9與咬合蛋白表達(dá)變化相關(guān)性分析提示兩者呈負(fù)相關(guān)，顯著相關(guān)。而且MMP-9和咬合蛋白均與腦水腫的形成密切相關(guān)，我們認(rèn)為腦創(chuàng)傷發(fā)生后通過(guò)炎癥反應(yīng)等激活MMP-9，而MMP-9降解了咬合蛋白，導(dǎo)致緊密連接破壞，血腦屏障通透性增高，腦水腫加重。

1 Marmarou A，F(xiàn)oda MA，van den Brink W，et al．A new model of diffuse brain injury in rats.Part I：Pathophysiology and biomechanics.Neurosurg,1994,80：291-300．

2 劉永亮，王鵬，李建民.腦損傷后腦水腫的發(fā)病機(jī)制研究進(jìn)展.中國(guó)醫(yī)藥指南，2013,11：76-78.

3 Wagner S,Nagel S,Kluge B,et al.Topographically graded postischemic presence of metalloproteinases is inhibited by hypothermia.Brain Res,2003,984:63-75.

4 Yu Q,Stamenkovic I.Localization of metalloproteinase 9 to the cell surface provides a mechanism for CD44-mediated tumor invasion.Genes Dev,1999,13:35-48.

5 Gidday JM，Gasche YG，Copin JC，et al．Leukocyte-derived matrix metalloproteinase-9 mediates blood-brain barrier breakdown and is proinflammatory after transient focal cerebral ischemia．Am J Physiol Heart Circ Physiol，2005，289：558-568.

6 Dzwonek J,Rylski M,Kaczmarek L.Matrix Metedloproteinases and their endogenous inhibitors in neuronal physiology of the adult brain.FEBS Lett,2004,67:129.

7 Yu AS,Mc Carthy KM,Francis SA,et al.Knockdown of occluding expression leads to diverse phenotypic alterations in epithelial cells.Am J Physiol Cell Physiol,2005,288:C1231-C1241.

ThechangesofexpressionofMMP-9andoccludininbraincortexofratswithdiffusebraininjuryandthecorrelationbetweenthechangesandbrainedema

ZHAOYiqun*,WANGLina,LIUYongliang,etal.*TheTenthHospitalofTangshanCity,Hebei,Tangshan063000,China

ObjectiveTo observe the changes of expression of MMP-9 and occludin in brain cortex of rats with diffuse brain injury and the changes of brain edema around injury region.MethodsThe 160 Sprague-Dawley adult male rats were randomly divided into control group (n=60) and model group (n=100).The animal models with diffuse brain injury were established in rats by means of Marmarou’s method.At 3h,12h,24h,72h and 144h after injury,brain water content was detected by dry wet weight measurement method in both groups,and the expression levels of MMP-9 and occludin around the injury area were measured by immunohistochemistry and Western Blot.Finally the correlation analysis was performed about these results.ResultsAs compared with that in control group,the brain water content in model group was significantly increased in different time points,and the expression levels of MMP-9 around injury area were obviously increased (P<0.05),however,the content of occludin was significantly decreased.The changes of brain water content were positively correlated to those of MMP-9 (P<0.05).However the changes of brain water content were negatively correlated to those of occludin expression levels (P<0.05),so were between MMP-9 expression and occludin expression.ConclusionAfter the diffuse traumatic brain injury,the expression levels of MMP-9 in brain cortex around injury area are obviously increased,however,the expression levels of occluding are significantly decreased,and brain edema appears.The increase of MMP-9 expression levels results in the decrease of occludin expression levels,as a result,brain edema occurs.

diffuse brain injury;brain edema;MMP-9;occludin

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.04.004

063000 河北省唐山市第十醫(yī)院(趙軼群)；河北省唐山市人民醫(yī)院(王麗娜)；河北聯(lián)合大學(xué)(劉永亮、王鵬)

R 651.1

A

1002-7386(2014)04-0495-04

2013-09-07)