EZH2與PCNA、P16蛋白在胃癌組織中表達(dá)的關(guān)系和意義

高德全 趙彥婷 劉云云 冀增海

·論著·

EZH2與PCNA、P16蛋白在胃癌組織中表達(dá)的關(guān)系和意義

高德全 趙彥婷 劉云云 冀增海

目的檢測(cè)EZH2、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、P16蛋白在胃癌及癌旁正常組織中的表達(dá)情況，分析EZH2與患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。方法收集62例胃癌手術(shù)患者的腫瘤及52例癌旁正常胃粘膜組織石蠟標(biāo)本進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，并收集患者的臨床病理特征及隨訪資料，同時(shí)檢測(cè)PCNA、P16蛋白的表達(dá)，分析這3種蛋白質(zhì)之間的關(guān)系；分析EZH2與胃癌患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果胃癌組織中EZH2、PCNA表達(dá)均較癌旁組織明顯增強(qiáng)(P<0.05)，P16蛋白在胃癌組織中表達(dá)明顯低于癌旁組織陽(yáng)性率(P<0.05)；胃癌組織中EZH2與PCNA表達(dá)有正相關(guān)關(guān)系(r=0.3846，P=0.002)，EZH2與P16蛋白表達(dá)存在負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.2756，P<0.05)；PCNA與P16表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)關(guān)系(P>0.05)。EZH2表達(dá)與胃癌腫瘤浸潤(rùn)深度、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)；預(yù)后分析顯示，EZH2強(qiáng)表達(dá)患者的生存期比弱表達(dá)者明顯縮短(P<0.05)。結(jié)論胃癌組織中EZH2蛋白表達(dá)明顯增高，與胃癌部分臨床病理特征有關(guān)，EZH2蛋白還可以作為預(yù)后指標(biāo)；EZH2蛋白在胃癌中的作用可能與其調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞增殖能力有關(guān)。

胃癌；果蠅zeste 基因增強(qiáng)子同源物2；增殖細(xì)胞核抗原；P16蛋白；臨床病理特征；預(yù)后

胃癌是我國(guó)發(fā)病率、病死率最高的消化道惡性腫瘤，對(duì)人民健康危害極大，但胃癌并無(wú)特異性臨床表現(xiàn)，很難早期發(fā)現(xiàn)，患者就診時(shí)多已處于進(jìn)展期，手術(shù)及化療效果不佳，預(yù)后較差。目前胃癌發(fā)病機(jī)制尚不明確，尋找與胃癌發(fā)生進(jìn)展關(guān)系密切的基因有可能作為新腫瘤標(biāo)志物對(duì)胃癌進(jìn)行診斷及預(yù)后預(yù)測(cè)，還可能確定腫瘤生物治療靶點(diǎn)。此類研究已成為胃癌研究熱點(diǎn)，但尚未取得突破性進(jìn)展。果蠅zeste 基因增強(qiáng)子同源物2(enhancer of zeste homolog 2,EZH2)是新近發(fā)現(xiàn)的原癌基因，與多種惡性腫瘤發(fā)生進(jìn)展有關(guān)[1-3]，但關(guān)于EZH2蛋白與胃癌臨床病理特征及預(yù)后關(guān)系的研究還比較少見(jiàn)。故本研究應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)比較了EZH2蛋白在胃癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)情況，同時(shí)分析了EZH2表達(dá)與胃癌臨床病理特征各指標(biāo)之間的關(guān)系，并探討EZH2蛋白與胃癌預(yù)后的關(guān)系；同時(shí)應(yīng)用免疫組化技術(shù)檢測(cè)了與胃癌組織中與腫瘤增殖關(guān)系密切的增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、P16蛋白的表達(dá)，探討了EZH2蛋白與PCNA、P16的關(guān)系及其意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集我院2005年8月至2011年7月確診為胃癌行手術(shù)切除腫瘤并術(shù)后病理證實(shí)的患者胃癌石蠟標(biāo)本62例，其中52例有癌旁正常組織。所有患者臨床病理資料完整，患者術(shù)前均未接受放、化治療，均有術(shù)后隨訪資料。其中男48例，女14例；年齡37～72歲，平均年齡(59.2±11.3)歲。兔抗人EZH2、PCNA、P16多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，免疫組化試劑盒購(gòu)自北京中杉生物技術(shù)公司。

1.2 免疫組化染色 組織均為4%多聚甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋后4 μm連續(xù)切片，進(jìn)行蘇木素-伊紅染色(hematoxylin-eosinstaining,HE)和免疫組化SP染色。切片經(jīng)脫蠟水化、3%過(guò)氧化氫孵育、蒸餾水沖洗等過(guò)程后PBS浸泡進(jìn)行抗原修復(fù)。免疫組化試劑盒操作過(guò)程：封閉、分別加入各一抗、孵育、沖洗后依次加二抗和辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液。DAB顯色，蘇木素復(fù)染，脫水，透明，中性樹(shù)脂封片。

1.3 免疫組化結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn) SP染色結(jié)果由兩位病理專業(yè)醫(yī)師雙盲閱片判斷。每張切片隨機(jī)取5個(gè)400倍視野，每視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞染色的陽(yáng)性率計(jì)算評(píng)分。EZH2、PCNA蛋白以細(xì)胞核出現(xiàn)黃褐色或棕褐色為染色陽(yáng)性，P16蛋白以細(xì)胞漿或細(xì)胞膜出現(xiàn)黃褐色或棕褐色為染色陽(yáng)性。記分標(biāo)準(zhǔn)如下：細(xì)胞內(nèi)陽(yáng)性表達(dá)率<10%記為陰性，陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)≥10%記為陽(yáng)性。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SAS 8.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)、Spearman相關(guān)分析、Kaplan-Meier生存分析方法對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌與癌旁正常組織中EZH2、PCNA、P16的免疫組化結(jié)果 免疫組化結(jié)果顯示，胃癌組織EZH2、PCNA表達(dá)與癌旁正常組織比較明顯增高，P16在胃癌組織中表達(dá)明顯低于癌旁正常組織(P<0.05)。見(jiàn)表1。Spearman相關(guān)結(jié)果顯示，胃癌組織中EZH2與PCNA表達(dá)存在正相關(guān)關(guān)系(r=0.3846，P=0.002)，EZH2與P16表達(dá)有負(fù)相關(guān)關(guān)系(r=-0.2756，P=0.030)；PCNA與P16表達(dá)無(wú)明顯相關(guān)關(guān)系(r=-0.2108，P=0.100)。

表1 EZH2、PCNA、P16在胃癌和癌旁組織中表達(dá)情況 例

2.2 EZH2蛋白表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系 單因素分析顯示，EZH2蛋白與胃癌腫瘤浸潤(rùn)深度、分化程度、TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)。EZH2蛋白與性別、年齡、腫瘤直徑、神經(jīng)血管侵犯、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移等特征無(wú)明顯關(guān)系(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 胃癌組織EZH2表達(dá)與腫瘤臨床病理特征的關(guān)系 例

2.3 EZH2蛋白表達(dá)與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系 62例胃癌患者有51例得到隨訪，隨訪截止日期為2011年8月，隨訪率為82.3%。應(yīng)用Kaplan-Meier生存分析檢驗(yàn)，EZH2蛋白表達(dá)陽(yáng)性患者的平均生存期為(20.17±1.92)月，EZH2陰性者平均生存期為(31.90±3.09)月，2組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2= 5.944,P=0.0148)。見(jiàn)圖1。

3 討論

胃癌由于起病隱匿、特異性癥狀不明顯，不易早期診斷。且胃癌進(jìn)展迅速，患者出現(xiàn)癥狀就診時(shí)往往已處于中晚期，綜合治療效果不佳。近年胃癌手術(shù)、化療技術(shù)雖有了較大進(jìn)步，但我國(guó)胃癌患者5年生存率仍僅為30%～40%。由于胃癌發(fā)病機(jī)制尚不明確，因此尋找與胃癌發(fā)生進(jìn)展有關(guān)的新基因意義重大。EZH2即是受到關(guān)注的基因之一。研究顯示，EZH2蛋白具有癌基因特征，在多種惡性腫瘤中表達(dá)上調(diào)，EZH2基因可促進(jìn)腫瘤的增殖、侵襲、血管生成能力，與膀胱癌、卵巢癌、鼻咽癌等腫瘤進(jìn)展有關(guān)[1,4,5]。而有關(guān)EZH2蛋白與胃癌臨床病理特征及預(yù)后關(guān)系的研究目前尚不多見(jiàn)。本結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EZH2蛋白在胃癌組織中表達(dá)比癌旁正常組織增強(qiáng)，說(shuō)明EZH2可能促進(jìn)胃癌腫瘤的發(fā)生、進(jìn)展。對(duì)EZH2蛋白與胃癌各項(xiàng)臨床病理特征的關(guān)系進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EZH2蛋白表達(dá)陽(yáng)性的患者與EZH2蛋白陰性者相比腫瘤浸潤(rùn)更深、分化程度更差、臨床分期更晚、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率更高，這說(shuō)明EZH2蛋白可能促進(jìn)胃癌轉(zhuǎn)移進(jìn)展。進(jìn)一步預(yù)后分析顯示，EZH2蛋白表達(dá)陽(yáng)性的胃癌患者生存期較陰性者短，提示EZH2蛋白可以作為胃癌預(yù)后指標(biāo)。但本研究樣本量較小，有待進(jìn)一步擴(kuò)大研究規(guī)模并進(jìn)行前瞻性研究，以便對(duì)EZH2蛋白在胃癌中的臨床意義予以闡明。

圖1 EZH2表達(dá)與胃癌患者預(yù)后關(guān)系的Kaplan-Meier生存分析結(jié)果

為了解EZH2蛋白促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖的機(jī)制，本研究同時(shí)檢測(cè)了與直接反映腫瘤細(xì)胞增殖能力的PCNA、P16蛋白的表達(dá)。腫瘤細(xì)胞中PCNA表達(dá)增強(qiáng)，該蛋白在分裂期細(xì)胞中表達(dá)增高，在靜止期細(xì)胞中無(wú)明顯表達(dá)，可作為評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖狀態(tài)的指標(biāo)，直接反映細(xì)胞的增殖狀態(tài)。研究表明，PCNA在惡性腫瘤中通過(guò)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖而使腫瘤進(jìn)展[6,7]。有研究顯示，惡性腫瘤中EZH2蛋白可通過(guò)促進(jìn)PCNA表達(dá)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[8]。本結(jié)果顯示，PCNA在胃癌

中的表達(dá)強(qiáng)于癌旁組織，EZH2蛋白與PCNA表達(dá)有正相關(guān)關(guān)系，與前述報(bào)道的結(jié)果符合。P16蛋白特異性作用于細(xì)胞周期G1期，可以阻止G1期細(xì)胞進(jìn)入S期從而抑制細(xì)胞增殖。P16蛋白功能缺失可導(dǎo)致細(xì)胞過(guò)度增殖甚至癌變，多種惡性腫瘤中P16蛋白表達(dá)均明顯降低[9,10]。本研究也證實(shí)P16蛋白在胃癌中表達(dá)明顯低于癌旁組織，且EZH2與P16蛋白有負(fù)相關(guān)關(guān)系，提示EZH2可能通過(guò)抑制P16蛋白而發(fā)揮促進(jìn)胃癌細(xì)胞增殖作用，但具體機(jī)制還需要進(jìn)行深入研究。

本研究發(fā)現(xiàn)EZH2蛋白表達(dá)與胃癌部分臨床病理特征有關(guān)系，EZH2蛋白陽(yáng)性表達(dá)可作為胃癌不良預(yù)后因子。EZH2蛋白參與胃癌進(jìn)展可能與EZH2蛋白調(diào)節(jié)PCNA、P16表達(dá)有關(guān)。但本研究樣本量較小，且僅對(duì)臨床現(xiàn)象進(jìn)行了觀察分析，具體機(jī)制還不明確。因此，進(jìn)一步研究中我們準(zhǔn)備擴(kuò)大樣本數(shù)，并對(duì)EZH2蛋白進(jìn)行功能和機(jī)制研究，闡明EZH2蛋白在胃癌中的具體作用。

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ThesignificanceofexpressionofEZH2,PCNA,P16ingastriccanceranditscorrelationwithpatient’sprognosis

GAODequan*,ZHAOYanting,LIUYunyun,etal.*TheFirstDepartmentofSurgery,People’sHospitalofPingshanCounty,Hebei,Pingshan050400,China

ObjectiveTo investigate the significance of expression of EZH2,proliferating cell nuclear antigen (PCNA),P16 in gastric cancer tissues and its correlation with clinicopathological characteristics and prognosis of patients.MethodsThe expression levels of EZH2,PCNA,P16 were tested by immunohistochemistry in 62 cases of gastric cancer tissues and 52 cases of tumor-adjacent tissues,and patients’ clinicopathological characteristics and follow-up data were collected.The correlation among the three kinds of proteins was analyzed,and the relationship between EZH2 and clinicopathological characteristics as well as prognosis of patients was analyzed.ResultsThe expression levels of EZH2 (69.35%) and PCNA (83.87%) in gastric cancer tissues were significantly higher than those (21.15%,38.46%) in tumor-adjacent tissues (P<0.05),however,the expression levels of P16 (33.87%) in gastric cancer tissues were significantly lower than those in tumor-adjacent tissues (73.08%,P<0.05).The expression levels of EZH2 were positively correlated with those of PCNA in gastric cancer tissues,however,the expression levels of EZH2 were negatively correlated to those of P16 (P<0.05),moreover,there was no obvious relationship between the expression of PCNA and that of P16 (P>0.05).The overexpression of EZH2 was related to the depth of tumor infiltration,differentiation degree,clinical TNM stage,lymph node metastasis (P<0.05).Prognosis analysis showed that that the survival duration in patients with overexpression of EZH2 was obviously shorter than that of patients with weak expression of EZH2 (P<0.05).ConclusionThe overexpression of EZH2 appears in gastric cancer tissues,which is related to clinicopathological characteristics of gastric cancer,moreover,EZH2 protein can be served as an index of prognosis evaluation,and its effect in gastric cancer may be correlated to regulating proliferation ability of tumor cells.

gastric cancer;enhancer of zeste homolog 2;proliferating cell nuclear antigen;P16 protein;clinicopathological characteristics;prognosis

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.04.003

050400 河北省平山縣人民醫(yī)院外一科(高德全)，婦科(趙彥婷)，骨科(劉云云)，外三科(冀增海)

R 735.2

A

1002-7386(2014)04-0492-03

2013-09-12)