微波輔助法提取構(gòu)樹葉總黃酮工藝優(yōu)化研究

王述柏，蔡晴霞，王建琳，邵 坤，張林林，單 虎，郭 沛，秦志華*

(1.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，山東青島 266109；2.青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，山東青島 266109)

近年來構(gòu)樹在我國種植面積廣，枝葉產(chǎn)量高，因其營養(yǎng)豐富在畜禽養(yǎng)殖中作為飼料資源得到了廣泛應(yīng)用。有研究表明，構(gòu)樹根皮、枝葉等部位中含有豐富的黃酮類化合物、生物堿、多糖等生物活性物質(zhì)，具有抗真菌、抗病毒、抗肝細(xì)胞毒、抗氧化、抑制酪氨酸酶和α-葡萄糖苷酶活性等生理作用，可用于治療真菌感染、癌癥、糖尿病等疾病，功效主要與其黃酮類成分有關(guān)。構(gòu)樹入藥最早記載于《名醫(yī)別錄》，用于治療水腫、痢疾等病癥，可見構(gòu)樹除具有較高的營養(yǎng)價值外，亦有較高的藥用價值。對構(gòu)樹中具有藥用活性的物質(zhì)如黃酮類等進(jìn)行提取及在畜禽疾病防控中合理利用具有重要的實踐應(yīng)用價值。

植物中黃酮類化合物的提取常用微波輔助提取法、加熱回流提取法等。微波輔助提取法具有選擇性強(qiáng)和高效性等特點，相較于加熱回流法反應(yīng)時間可節(jié)省50%～90%；加熱回流提取法主要使用乙醇等有機(jī)溶劑對樣品中的有效成分進(jìn)行提取，反應(yīng)時間較長，有利于樣品與溶劑充分接觸使目標(biāo)物質(zhì)充分浸出，但因反應(yīng)時間過長、溫度過高易使有效成分失活。目前有關(guān)構(gòu)樹中黃酮類等生物活性物質(zhì)的提取技術(shù)研究報道較少。該試驗采用單因素和正交試驗設(shè)計研究了采用微波輔助法提取構(gòu)樹葉總黃酮的最優(yōu)提取工藝，旨在探討構(gòu)樹葉總黃酮的高效、低成本提取工藝條件，從而為其在畜禽健康養(yǎng)殖中的開發(fā)利用提供科學(xué)方法。

1 材料與方法

主要試劑。構(gòu)樹葉粉末(過40目篩)；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(索萊寶生物科技有限公司)；無水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鹽、氫氧化鈉(分析純，天津恒興化學(xué)試劑制造有限公司)。試驗在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院實驗室，于2017年5—7月進(jìn)行。

主要儀器。AR2140電子分析天平(上海奧斯豪國際貿(mào)易公司)；XH-100A微波催化合成/萃取儀(北京祥鵠科技發(fā)展有限公司)；WFZ754型紫外可見分光光度計(上海光譜儀器有限公司)；KDM電子調(diào)溫電熱套(龍口市先科儀器有限公司)。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品加少量無水乙醇溶解，70%乙醇溶液定容，即得蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液。根據(jù)NaNO-Al(NO)-NaOH比色法檢測510 nm下不同濃度蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品溶液的吸光度。以蘆丁質(zhì)量濃度(mg/mL)為橫坐標(biāo)、吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出回歸方程為=10623-0003 5(=0999 4)。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of rutin

微波輔助提取法提取工藝條件篩選。采用單因素試驗設(shè)計，分別對提取時間、提取溫度、微波功率、料液比、乙醇濃度5個因素設(shè)置5個水平，以總黃酮提取量為評價指標(biāo)，篩選最優(yōu)條件。

(1)提取時間。提取時間分別設(shè)置為3、5、7、9、11 min，其他提取條件一致，即以50%乙醇為溶劑，料液比為1∶20(g∶mL)，提取溫度為55 ℃，微波功率設(shè)置為400 W。

(2)提取溫度。提取溫度分別設(shè)置為55、60、65、70、75 ℃，其他提取條件一致，即以50%乙醇為溶劑，料液比為1∶20，提取時間9 min，微波功率設(shè)置為400 W。

(3)微波功率。微波功率分別設(shè)置為300、400、500、600、700 W，其他提取條件一致，即以50%乙醇為溶劑，料液比為1∶20，提取溫度70 ℃，提取時間9 min。

(4)料液比。料液比分別設(shè)置為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35，其他提取條件一致，即以50%乙醇為溶劑，微波功率為400 W，提取溫度為70 ℃，提取時間9 min。

(5)乙醇濃度。以乙醇為溶劑，提取濃度分別設(shè)置為40%、50%、60%、70%、80%，其他提取條件一致，即微波功率500 W，料液比為1∶30，提取溫度70 ℃，提取時間9 min。

上述試驗均采用NaNO-Al(NO)-NaOH比色法測定OD值，根據(jù)“..”標(biāo)準(zhǔn)曲線計算提取液中總黃酮含量。

提取工藝優(yōu)化試驗。根據(jù)“..”單因素試驗獲得的最佳參數(shù)，以乙醇濃度(A)、提取時間(B)、料液比(C)、提取溫度(D)、微波功率(E)為考察因素，每個因素設(shè)置4個水平，采用L(4)正交試驗設(shè)計(表1)研究最佳工藝，以提取液中總黃酮含量為評價指標(biāo)。

最佳工藝條件驗證試驗。對“..”獲得的最佳工藝進(jìn)行驗證，即取1.0 g構(gòu)樹葉粉末，采用最佳提取工藝進(jìn)行總黃酮提取，重復(fù)5次，檢測提取液中總黃酮含量。

最佳工藝放大試驗。精確稱取10.0 g構(gòu)樹葉粉末，采用“..”的最佳提取工藝進(jìn)行總黃酮提取，重復(fù)5次，檢測提取液中總黃酮含量。粗提液采用AB-8型樹脂分離純化。

表1 微波輔助法提取工藝的L16(45)正交試驗設(shè)計

試驗數(shù)據(jù)采用Excel 2016軟件初步整理，采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

從圖2可以看出，隨著提取時間延長，構(gòu)樹葉總黃酮的提取量逐漸增加，9 min時達(dá)到峰值，之后呈現(xiàn)下降趨勢。

圖2 不同提取時間對總黃酮提取量的影響Fig.2 Effect of different extraction time on the extraction content of total flavonoids

從圖3可以看出，隨著提取溫度升高，構(gòu)樹葉總黃酮的提取量迅速增多，70 ℃時達(dá)到峰值，之后呈下降趨勢。

圖3 不同提取溫度對總黃酮提取量的影響Fig.3 Effect of different extraction temperature on the extraction content of total flavonoids

從圖4可以看出，構(gòu)樹葉總黃酮提取量隨微波功率增加(300～600 W)逐漸增多，600 W時到達(dá)峰值，隨后隨功率呈下降趨勢。

圖4 不同微波功率對總黃酮提取量的影響Fig.4 Effect of different microwave power on the extraction content of total flavonoids

從圖5可以看出，料液比在1∶15～1∶30，隨著料液比的增加總黃酮提取量呈增加趨勢，1∶30時達(dá)到峰值，之后呈下降趨勢。

圖5 不同料液比對總黃酮提取量的影響Fig.5 Effect of different solid-liquid ratio on the extraction content of total flavonoids

從圖6可以看出，隨著乙醇濃度增加構(gòu)樹葉總黃酮提取量呈先升高后下降趨勢，乙醇濃度為70%時，總黃酮提取量達(dá)到峰值。

圖6 不同乙醇濃度對總黃酮提取量的影響Fig.6 Effect of different ethanol concentration on the extraction content of total flavonoids

由表3可知，各因素對構(gòu)樹葉總黃酮提取量的影響從大到小依次為A>B>E>C>D，最佳提取條件為ABCDE。

方差分析結(jié)果表明，試驗數(shù)據(jù)具有統(tǒng)計學(xué)意義。綜合考慮，最終確定的最佳提取工藝為乙醇濃度70%、提取時間9 min、料液比1∶35、提取溫度70 ℃、微波功率700 W。

表3 正交試驗結(jié)果分析

最佳工藝條件驗證試驗結(jié)果顯示，在最佳提取工藝條件下自1 g構(gòu)樹葉提取的提取液中總黃酮含量為25.83 mg/g，RSD為0.71%。高于正交設(shè)計表中的最大值，表明所確定的提取工藝穩(wěn)定性和可靠性較好。

最佳工藝放大試驗結(jié)果顯示，在最佳提取工藝條件下自10 g構(gòu)樹葉提取的提取液中總黃酮含量為26.12 mg/g，與放大前試驗提取量基本一致，進(jìn)一步驗證了所建立提取工藝具有良好的穩(wěn)定性、可靠性。經(jīng)純化后總黃酮含量為52.17 mg/g。

3 討論與結(jié)論

楚冰芳等研究發(fā)現(xiàn)在超聲頻率40 kHz下，構(gòu)樹葉總黃酮的最佳提取工藝條件為料液比1∶30(g∶mL)、超聲時間40 min、乙醇濃度50%、超聲溫度50 ℃。艾微等研究發(fā)現(xiàn)采用微波輔助法提取藿香葉總黃酮的最佳工藝為料液比1∶60(g∶mL)、乙醇濃度60%、微波功率567 W、提取時間70 s。周一鳴等研究發(fā)現(xiàn)微波提取苦蕎皮中總黃酮的最佳工藝條件為pH 10.0、乙醇濃度50.3%、料液比1∶32.6、預(yù)浸時間19.7 min、反應(yīng)溫度70 ℃、反應(yīng)時間20 min。高岐等研究發(fā)現(xiàn)采用微波輔助提取洋蔥中的黃酮類化合物的最佳工藝條件為料液比1∶10、反應(yīng)功率900 W、反應(yīng)時間5 min、乙醇濃度為80%。焦士蓉等研究確定微波輔助提取蘆柑皮中黃酮類物質(zhì)的最佳工藝條件為乙醇濃度80%、微波功率280 W、料液比1∶25，每次反應(yīng)時間為80 s，反復(fù)3次。易燦等研究發(fā)現(xiàn)山銀花總黃酮的最佳微波輔助提取法工藝為料液比1∶20.5(g∶mL)、提取時間8.0 min、乙醇濃度60.5%、微波功率394 W。楊永濤研究了羅布麻總黃酮的微波輔助提取法，確定最佳工藝為乙醇濃度55%、提取溫度50 ℃、提取時間25 min、料液比為1∶35(g∶mL)、超聲功率400 W。由此可見，不同植物種類中黃酮類化合物的提取工藝條件不盡一致。

該試驗以乙醇為溶劑，采用單因素和正交試驗優(yōu)化后得到的微波輔助提取法提取構(gòu)樹葉總黃酮的最優(yōu)工藝為乙醇濃度70%、提取溫度70 ℃、提取時間9 min、料液比1∶35(g∶mL)、微波功率700 W，該工藝與上述報道比較具有需時短的優(yōu)勢；驗證試驗結(jié)果顯示該提取工藝穩(wěn)定性較好，因此用于構(gòu)樹葉總黃酮的提取具有較好的實用性。