北京地區(qū)攜帶OXA-1型超廣譜-內(nèi)酰胺酶志賀菌耐藥特點研究

苗元 盧立新 吳本和 王永全 靳博 崔京輝 張晶波 王全意

·藥物研究·

北京地區(qū)攜帶OXA-1型超廣譜-內(nèi)酰胺酶志賀菌耐藥特點研究

苗元 盧立新 吳本和 王永全 靳博 崔京輝 張晶波 王全意

目的了解本地區(qū)志賀菌中攜帶OXA-1型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(exteneded spectrum beta-lactamases,ESBLs)耐藥基因型及耐藥特征。方法收集2008至2011年分離出的志賀菌83株，聚合酶鏈反應(PCR)檢測OXA-1型耐藥基因，陽性產(chǎn)物序列在GenBank上比對確定基因亞型；對攜帶OXA-1型耐藥基因菌株按照Kirby-Bauer法進行藥物敏感性試驗，測定志賀菌對8種頭孢類抗生素耐藥情況。結(jié)果83株志賀菌中，21株攜帶OXA-1型ESBLs基因，陽性率為28.57%，其中21株福氏志賀菌檢出15株，61株宋內(nèi)志賀菌檢出6株。陽性產(chǎn)物均為OXA-1亞型。藥敏結(jié)果顯示，攜帶OXA-1型基因菌株對頭孢噻吩、頭孢唑林等頭孢類抗生素耐藥，對頭孢西丁、頭孢他啶、頭孢吡肟和頭孢哌酮等頭孢類抗生素均敏感。結(jié)論本地區(qū)志賀菌中以攜帶OXA-1亞型ESBLs耐藥基因為主，在福氏志賀菌中檢出高于宋內(nèi)志賀菌，該基因與志賀菌對頭孢類抗生素的耐藥性呈一定相關(guān)性。

志賀菌；超廣譜β-內(nèi)酰胺酶；OXA-1型；耐藥性

OXA型廣譜β-內(nèi)酰胺酶(exteneded spectrum beta-lactamases,ESBLs)是從20世紀80年代后期從絲氨酸β-內(nèi)酰胺酶中分離，在分子分類上屬于D類，功能分類上屬于2d類ESBLs[1]，是對頭孢類抗生素耐藥的重要原因之一。OXA型ESBLs有OXA-1、OXA-2和OXA-10三個基因來源，但同源性僅為20%～30%，在分子水平上OXA型ESBLs分為5組，其中第Ⅲ組包括OXA-1、OXA-4、OXA-30和OXA-31等亞型[2]。在志賀菌中，攜帶OXA型酶菌株也常有報道，但檢出以O(shè)XA-1型ESBLs為主。為此，本研究收集了2008至2011年本地區(qū)從腹瀉患者糞便標本中分離出的連續(xù)的不重復的志賀菌共83株，研究其OXA-1型ESBLs耐藥基因檢出情況，并對其進行耐藥性分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2008至2011年本轄區(qū)內(nèi)北京兒童醫(yī)院、北京大學人民醫(yī)院、北京大學第一醫(yī)院，積水潭醫(yī)院等10家腸道門診開診期間上送菌株及本實驗室從腹瀉病患者糞便標本中分離培養(yǎng)的志賀菌共83株，其中福氏志賀菌21株，宋內(nèi)志賀菌61株，鮑氏志賀菌1株。

1.2 OXA-1型ESBLs耐藥基因檢測 采用煮沸法提取菌體及質(zhì)粒DNA。OXA-1型耐藥基因引物序列為：正向引物5’-ACACAATACATATCAACTTCGC-3’，反向引物5’-AGTGTGTTTAGAATGGTGATC-3’。反應條件為：94℃預變性3 min；94℃變性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸1 min，30循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR擴增產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色，美國Bio-Rad公司凝膠成像系統(tǒng)照相。引物序列由大連(寶)生物工程有限公司合成。

1.3 OXA-1型基因DNA測序及序列分析 PCR擴增在美國Bio-Rad公司的iCycler PCR上進行， PCR陽性擴增產(chǎn)物委托北京金螺旋生物科技公司純化、測序。測序使用雙脫氧末端終止法，在ABI3730XL測序儀上進行雙向測序，序列拼接后通過NCBI BLAST程序在GenBank上查詢比較，確定基因亞型。

1.4 藥物敏感性試驗 根據(jù)PCR擴增結(jié)果，將攜帶OXA-1型耐藥基因菌株，按照CLSI推薦的Kirby-Bauer法進行藥物敏感性試驗測定對8種頭孢類抗生素耐藥情況。抗菌藥物頭孢噻吩、頭孢唑林、頭孢西丁、頭孢噻肟、頭孢他啶、頭孢哌酮、頭孢吡肟、氨曲南及MH培養(yǎng)基干粉購自英國Oxoid公司。質(zhì)控菌株使用大腸埃希菌ATCC25922。

2 結(jié)果

2.1 OXA-1基因PCR檢測結(jié)果 83株志賀菌中共有21株檢出OXA-1型核酸陽性，陽性率為25.3%(21/83)。其中福氏志賀菌中檢出15株，宋內(nèi)志賀菌中檢出6株。對核酸陽性的產(chǎn)物進行測序，將測序結(jié)果拼接后，在GenBank上經(jīng)BLAST比對，全部為目的序列，無假陽性出現(xiàn)，基因亞型為OXA-1亞型。見表1。

表1 不同血清型志賀菌OXA型耐藥基因檢出結(jié)果

2.2 攜帶OXA-1型耐藥基因菌株藥敏試驗結(jié)果 根據(jù)核酸檢測結(jié)果，對檢出攜帶OXA-1型耐藥基因的21株志賀菌進行藥敏試驗。實驗結(jié)果判定根據(jù)Oxoid藥敏紙片說明書中規(guī)定腸桿菌科的抑菌環(huán)直徑解釋標準，判定耐藥(R)和敏感(S)。21株攜帶OXA-1型耐藥基因的志賀菌菌株對頭孢噻吩的耐藥性最高，耐藥率為61.90%，其次為頭孢唑林，耐藥率為28.57%。對頭孢噻肟、氨曲南等頭孢類抗生素有一定耐藥性，耐藥率都達到19.05%。對頭孢西丁、頭孢他啶、頭孢哌酮和頭孢吡肟較敏感，耐藥率最高不超過10%。見表2。

表2 攜帶OXA-1型耐藥基因菌株藥敏試驗結(jié)果 株

3 討論

有研究表明OXA型β-內(nèi)酰胺酶在不同類微生物體內(nèi)水解β-內(nèi)酰胺抗生素能力存在差異[3]，早期的文獻報道OXA型β-內(nèi)酰胺酶主要存在于銅綠假單胞菌[4]和鮑曼不動桿菌[5]中，而在志賀氏菌中偶有發(fā)現(xiàn)[6]。但隨著近年志賀菌耐藥現(xiàn)象日益嚴重及對耐藥機制的研究深入，志賀菌中檢出OXA型β-內(nèi)酰胺酶的報道逐漸增多。在國內(nèi)，葉穎子等[7]2008年從51株福氏志賀氏菌中檢出45株攜帶OXA-1群ESBLs基因，陽性率高達88.2%；紀文靜等[8]從2004-2008年期間搜集的59株志賀菌中檢出6株攜帶OXA-1亞型ESBLs基因；本實驗對83株志賀氏菌進行檢測后發(fā)現(xiàn)，21株發(fā)現(xiàn)攜帶OXA-1亞型ESBLs基因，陽性率為25.3%。陽性率產(chǎn)生差異的原因與各地區(qū)用藥習慣不同有一定關(guān)系，但本研究發(fā)現(xiàn)OXA-1亞型ESBLs耐藥基因在福氏志賀菌中檢出率高于宋內(nèi)志賀菌，如此次從61宋內(nèi)志賀菌中只檢出6株(9.8%)攜帶OXA-1亞型耐藥基因，從21株福氏志賀菌檢出15株(71.4%)攜帶OXA-1亞型耐藥基因，福氏志賀氏菌OXA-1耐藥基因陽性率與葉穎子等的研究結(jié)果相近(88.2%)。而鮑春梅等[9]從43株多重耐藥宋內(nèi)志賀菌中未檢出OXA基因?qū)嶒灲Y(jié)果也證實該基因在宋內(nèi)志賀菌中檢出率偏低，此發(fā)現(xiàn)為國內(nèi)首次報道。

該酶之所以命名為OXA型酶，是因為其除耐氨芐西林、頭孢噻吩外，對其他頭孢菌素的水解能力不一，但對苯唑西林、氯唑西林有很強的水解能力[10]。有國內(nèi)學者指出，是否攜帶OXA耐藥基因與志賀菌對β內(nèi)酰胺類抗生素的耐藥率無關(guān)[8]。但本研究發(fā)現(xiàn)，攜帶OXA耐藥基因志賀菌對頭孢噻吩的耐藥率達到61.9%，對頭孢唑林的耐藥率達到28.6%，對頭孢噻肟、氨曲南等頭孢類抗生素有一定耐藥性。耐藥菌株中只有少部分攜帶其它ESBLs類耐藥基因，如CTX-M、TEM、SHV等(另文發(fā)表)，說明其對頭孢類抗生素會產(chǎn)生一定耐藥性。

由于編碼OXA型酶的基因常位于質(zhì)粒和整合子中，具有很強的擴散能力，所以控制其流行傳播刻不容緩。因此加強對該類型ESBLs耐藥基因的監(jiān)測，并結(jié)合藥物敏感性實驗結(jié)果，以期達到指導臨床合理使用抗菌藥物，延緩細菌耐藥性產(chǎn)生，控制耐藥菌株的傳播以及研發(fā)穩(wěn)定、高效抗菌藥物方面具有十分重要的意義。

1 張卓然,夏夢巖,倪語星主編.微生物耐藥的基礎(chǔ)與臨床.第1版.北京:人民衛(wèi)生出版社，2007.127-130.

2 Bert F,Branger C,Lambert-Zechovsky N.Identification of PSE and OXA -lactamase genes in Pseudamanas aeruginosa using PCR-restriction fragment length polymorphism.J Antimicrob Chemother,2002,50:11-18.

3 周偉琳,俞云松,馬亦林.超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的分類.中國抗感染化療雜志,2002,12:245-248.

4 weldhagen G，Poirel L，Nordmann P．Ambler class A exterlded-spectrum beta-lactamases in Pseudomonas aeruginosa:novel developments and clinical impact.Antimicrob Agents Chemother,2003,47:2385-2392．

5 Boo TW,Walsh F,Crowley B.First report of OXA-23 carbapenemase in clinical isolates of Acinetobacter species in the Irish Republic.J Antimicrob Chemother,2006,58:1101-1102.

6 Siu LK,Lo JY,Yuen KY,et al.β-lactamases in Shigella flexneri solates from Hong Kong and Shanghai and a Novel OXA-1-like β-lactamases,OXA-30.Antimicrob Agents Chemother,2000,44:2034-2038.

7 葉穎子,俞蕙,王曉紅，等.兒童福氏志賀菌OXA型β內(nèi)酰胺酶耐藥基因及其耐藥性檢測.中國實用兒科雜志,2008,9:687-689.

8 紀文靜,徐樨巍,董方.兒科產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶志賀菌的基因型和耐藥性研究.中華微生物和免疫學雜志，2010,30:472-476.

9 鮑春梅,郭桐生,崔恩博，等.產(chǎn)ESBLs宋內(nèi)志賀菌耐藥基因分布研究.軍事醫(yī)學,2011,2:122-127.

10 劉曉一,劉文恩.OXA型超廣譜β-內(nèi)酰胺酶的研究進展.中國感染控制雜志,2010,6:462-467.

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.07.055

項目來源:北京市西城區(qū)科技計劃項目(編號：XCKJJH2013-27)

100120 北京市西城區(qū)疾病預防控制中心檢驗科(苗元、盧立新、吳本和、王永全、靳博、崔京輝、張晶波)；北京市疾病預防控制中心(王全意)

R 96

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1002-7386(2014)07-1081-02

2013-10-12)