結(jié)直腸癌組織與血液KRAS/BRAF基因突變表達(dá)一致性檢測(cè)分析

馬文華 李娜 趙利平 張明明 安永輝

·論著·

結(jié)直腸癌組織與血液KRAS/BRAF基因突變表達(dá)一致性檢測(cè)分析

馬文華 李娜 趙利平 張明明 安永輝

目的我國(guó)大部分結(jié)直腸癌患者發(fā)現(xiàn)的時(shí)候已經(jīng)是中晚期，很難取到病理組織行KRAS、BRAF基因檢測(cè)，故限制靶向藥物應(yīng)用，此實(shí)驗(yàn)研究目的是對(duì)原發(fā)腫瘤和血清KRAS/BRAF基因突變一致性進(jìn)行研究。方法共納入48例患者，分別對(duì)血清和腫瘤組織中KRAS及BRAF基因表達(dá)情況采用液相芯片技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果原發(fā)腫瘤組織KRAS突變率40%(19/48)，血清42%(20/48)。在19例腫瘤組織樣本KRAS突變，14例血清樣本中的相同的突變，符合率73.7%(14/19)。在1個(gè)腫瘤組織檢測(cè)到BRAF基因突變，在血清樣本中未發(fā)現(xiàn)BRAF基因突變。結(jié)論在KRAS基因的原發(fā)腫瘤和配對(duì)血清樣本之間突變率有很好的一致性。

結(jié)直腸癌；KRAS基因；BRAF基因；突變；液相芯片技術(shù)

結(jié)直腸癌作為最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，位居癌癥死因第3 位，每年有超過(guò)一百萬(wàn)的大腸癌新增病例[1]。目前抗EGFR治療基因靶標(biāo)臨床研究主要集中于KRAS、BRAF基因。BRAF基因的突變是野生型KRAS患者療效不佳主要因素[2]。在結(jié)直腸癌應(yīng)用靶向藥物之前行KRAS基因突變檢測(cè)已經(jīng)被NCCN指南推薦。而行BRAF基因突變檢測(cè)也是必要的。但中晚期結(jié)直腸癌患者組織標(biāo)本獲取率低，許多晚期結(jié)直腸癌患者很難在治療前及治療中取得組織標(biāo)本以明確KRAS、BRAF基因突變狀況。另外由于腫瘤組織的異質(zhì)性、原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移灶基因型表達(dá)存在差異[3]。本研究對(duì)腫瘤組織及血清KRAS、BRAF突變情況分別進(jìn)行檢測(cè)，探討在結(jié)直腸腫瘤組織與血液中KRAS /BRAF之間的一致性程度，確定血液中KRAS/BRAF基因突變情況是否可以替代結(jié)直腸癌組織學(xué)基因檢測(cè)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 患者2010年8月至2013年8月，共有45例。這些患者均經(jīng)病理組織學(xué)證實(shí)。并通過(guò)影像學(xué)及手術(shù)結(jié)果，根據(jù)美國(guó)癌癥聯(lián)合委員會(huì)(AJCC)結(jié)直腸癌的TNM分期系統(tǒng)進(jìn)行分期。

1.2 標(biāo)本制備與檢測(cè)方法 組織標(biāo)本為手術(shù)切除腫瘤組織或石蠟包埋切片；采集外周血5 ml，基因突變檢測(cè)由廣州益善公司負(fù)責(zé)檢測(cè)，采用液相芯片技術(shù)進(jìn)行突變檢測(cè)，此技術(shù)具有特異性強(qiáng)，靈敏度高，重復(fù)性好的特點(diǎn)，突變富集-液相芯片技術(shù)特別適用于血漿、胸腹水等體液標(biāo)本的檢測(cè)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 15.0軟件，應(yīng)用Kapparel統(tǒng)計(jì)方法，κ系數(shù)(k≥0.7較高的一致性， 0.7>κ≥0.4一致性一般， κ<0.4一致性較差)被用來(lái)比較組織與血清K-RAS，B-RAF基因突變的一致性。

2 結(jié)果

2.1 患者的特點(diǎn) 在48例患者中，男32例，女16例；年齡27～83歲，平均年齡56歲。原發(fā)腫瘤位于結(jié)腸有26例(54.2%)，位于直腸22例(45.8%)。腫瘤分期情況如下：患者為Ⅰ期4例，Ⅱ期18例，Ⅲ期20例和Ⅳ期6例。

2.2 KRAS基因腫瘤組織與血清突變情況 在48個(gè)樣本中，原發(fā)腫瘤組織KRAS突變率40%(19/48)，血清42%(20/48)。在19例腫瘤組織樣本KRAS突變，14例血清樣本中的相同的突變，符合率73.7%(14/19)。突變位點(diǎn)位于相同密碼子。9例KRAS突變情況的不一致(27.8%)，其中5例在腫瘤組織中KRAS突變但血清中為野生型, 4例血清中KRAS基因突變但組織中為野生型。腫瘤組織和血液樣本KRAS突變率之間的一致性較高(κ= 0.60),分別行ⅠⅡ期、Ⅲ期、Ⅳ期KRAS基因組織與血清突變符合率比較，突變符合率與分期無(wú)關(guān)。見(jiàn)表1、2。

表1 KRAS/BRAF基因在組織與血清表達(dá)情況

表2 血清和原發(fā)腫瘤KRAS突變統(tǒng)計(jì)分析(kappa=0.60)

2.3 BRAF腫瘤組織和血清突變情況 在1個(gè)腫瘤組織檢測(cè)到BRAF基因突變，占2%(1/48)，在血清樣本中未發(fā)現(xiàn)BRAF基因突變，考慮到基因表達(dá)率低，此次研究樣本量少，故未行統(tǒng)計(jì)分析。

3 討論

KRAS基因突變是結(jié)直腸癌發(fā)展過(guò)程中早期常見(jiàn)事件。大約35%～45%的人類腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)KRAS基因突變[4]，并且KRAS基因活化在腫瘤發(fā)生中可能作為啟動(dòng)事件。既往研究報(bào)道可在血液中檢測(cè)到腫瘤細(xì)胞[5,6]，鄒江等[7]用PCR-RFLP法檢測(cè)結(jié)直腸癌患者血漿和癌組織的KRAS基因突變，結(jié)果表明組織與血漿間有很好的一致性。

BRAF和KRAS同屬M(fèi)AP激酶(MAPK)通路成員，分為ARAF、BRAF、CRAF三個(gè)亞型，而B(niǎo)RAF在3個(gè)亞型中突變頻率最高, 大約7%～8%的人類腫瘤發(fā)生BRAF突變[8], 主要發(fā)生于結(jié)腸癌、黑色素瘤和甲狀腺癌中。該突變導(dǎo)致下游MEK-ERK 信號(hào)通路持續(xù)激活, 對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)增殖和侵襲轉(zhuǎn)移至關(guān)重要, 是抗黑色素瘤等V600E 突變腫瘤的有效作用靶標(biāo)之一。2011年,首個(gè)BRAFV600E 靶向抑制劑威羅菲尼被FDA 批準(zhǔn)上市, 用于治療BRAFV600E 突變的晚期黑色素瘤患者[9]， BRAF和KRAS突變是相互排斥的。在這項(xiàng)研究中，只有1例患者檢測(cè)到BRAF基因突變發(fā)生在野生型KRAS患者中。

既往研究表明，血清游離DNA可能來(lái)源于細(xì)胞凋亡或壞死的腫瘤細(xì)胞釋放在血清中。另一個(gè)可能的機(jī)制是，游離循環(huán)DNA是由活細(xì)胞主動(dòng)釋放[10]。因此他是利用血清檢測(cè)來(lái)預(yù)測(cè)組織基因突變的理論基礎(chǔ)，因臨床工作中部分病人病理組織不能獲取，而血清取得方便性，如通過(guò)試驗(yàn)研究?jī)烧咧g有高度一致性，則KRAS/BRAF基因突變的檢測(cè)可能是由血清標(biāo)本中的基因突變的檢測(cè)取代。

在本研究中，我們首先評(píng)估了血清樣品中KRAS和BRAF基因突變之間的一致性程度，KRAS基因突變?cè)诮M織與血清中(K=0.60)存在一致性，故由此可推薦對(duì)于不能獲取組織的患者可通過(guò)血清檢測(cè)來(lái)替代。因BRAF突變率低，血清中未發(fā)現(xiàn)突變，未行統(tǒng)計(jì)分析。

本研究中基因突變率組織與血清并不完全一致，可能與循環(huán)DNA或轉(zhuǎn)移組織與原發(fā)腫瘤存在異質(zhì)性有關(guān)[10]。另一種可能性是腫瘤組織基因檢測(cè)因取材局限性，所以并不能反映腫瘤的整體基因情況；此外，釋放的DNA的血漿被稀釋，檢測(cè)技術(shù)的敏感性等都有可能妨礙了血漿DNA突變情況檢測(cè)準(zhǔn)確性。

通過(guò)此研究，我們已經(jīng)證明循環(huán)KRAS突變的血清和原發(fā)性大腸癌的腫瘤一致。我們認(rèn)為血漿KRAS基因突變情況可以反映結(jié)直腸癌腫瘤組織的KRAS基因突變情況，為檢測(cè)腫瘤靶點(diǎn)提供新的檢測(cè)方法。也為無(wú)法取得病理組織患者帶來(lái)新的治療希望，此研究不足之處在于樣本量偏少，希望能擴(kuò)大研究樣本量，進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)，并能基于血清基因突變情況開(kāi)展靶向治療研究。

1 Ferlay J,Shin HR,Bray F,et al.Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008.Int J Cancer,2010,127: 2893-2917．

2 Loupakis F, Ruzzo A, Cremolini C, et al.KRAS codon 61, 146 and BRAF mutations predict resistance to cetuximab plus irinotecan in KRAS codon 12 and 13 wild-type metastatic colorectal cancer.Br J Cancer，2009，101:715-721.

3 Di Fiore F, Charbonnier F, Lefebure B,et al.Clinical interest of KRAS mutation detection in blood for anti-EGFR therapies in metastatic colorectal cancer.Br J Cancer，2008，99:551-552.

4 Plesec TP,Hunt JL.KRAS mutation testing in colorectal cancer.Adv Anat Pathol,2009,16:196-203.

5 Stroun M,Anker P,Maurice P,et al.Neoplastic characteristics of the DNA found in the plasma of cancer patients.Oncology,1989,46:318-322．

6 Goebel G,Zitt M,Zitt M,et al.Circulating nucleic acids in plasma or serum (CNAPS) as prognostic and predictive markers in patients with solid neoplasias.Dis markers，2005,21:105-120.

7 鄒江，錢(qián)家鳴，李曉,等.血漿K-ras基因突變檢測(cè)在結(jié)腸癌診斷中的意義.中華腫瘤內(nèi)科雜志，2002，22:371-373.

8 Cutler RE, Jr Stephens RM, Saracino MR, et al.Autoregulation of the Raf-1 serine/threonine kinase.Proc Natl Acad Sci USA,1998,95:9214-9219.

9 Vultur A, Villanueva J, Herlyn M.Targeting BRAF in advanced melanoma: a first step toward manageable disease.Clin Cancer Res, 2011, 17: 1658-1663.

10 Pathak AK, Bhutani M, Kumar S, et al.Circulating cell-free DNA in plasma/serum of lung cancer patients as a potential screening and prognostic tool.Clin Chem，2006，52:1833-1842.

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.07.037

050031 石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院腫瘤科

安永輝，050031 河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院腫瘤科；

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R 735.3

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1002-7386(2014)07-1048-03

2013-11-14)