免疫膠體金法與培養(yǎng)方法檢測沙門氏菌檢測結(jié)果研究

劉景武 付素蘭 任天紅 張榮 張蕊 孫文澤

·論著·

免疫膠體金法與培養(yǎng)方法檢測沙門氏菌檢測結(jié)果研究

劉景武 付素蘭 任天紅 張榮 張蕊 孫文澤

目的評價(jià)自制沙門氏菌膠體金試紙對沙門氏菌檢測的真實(shí)性、可靠性和實(shí)用性．探討其用于沙門氏菌引起的食物中毒臨床標(biāo)本的快速檢測的應(yīng)用價(jià)值。方法用培養(yǎng)法作為金標(biāo)準(zhǔn)，并用膠體金方法對同一份標(biāo)本進(jìn)行檢測，對膠體金方法的診斷試驗(yàn)的評價(jià)指標(biāo)作出計(jì)算。結(jié)果兩種方法的檢測結(jié)果之間有極好的一致性(Φ=0.903，Kappa=0.898)，膠體金法診斷沙門氏菌與金標(biāo)準(zhǔn)方法的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，膠體金法檢測沙門氏菌診斷試驗(yàn)的靈敏度為81.8%，特異性為100%，符合率為99.6%，陽性預(yù)測值為100%，陰性預(yù)測值為99.6%，假陰性率為18.2%，假陽性率為0。結(jié)論膠體金法在基層、和突發(fā)公共衛(wèi)生事件時(shí)，在對沙門氏菌檢測工作中具有一定的應(yīng)用價(jià)值．該方法的特異性高，一致性也較高，但其靈敏度仍有待提高。

沙門氏菌；免疫膠體金；培養(yǎng)；診斷試驗(yàn)

沙門氏菌是腸桿菌科中的一個(gè)重要菌屬，是人和動(dòng)物的常見病原菌?？梢鹑祟惗喾N疾病，如食物中毒、胃腸炎、菌血癥、腸熱癥等。目前，對于沙門氏菌有很多檢測方法，如免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法、以及傳統(tǒng)的金標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法。但是，在應(yīng)對突發(fā)公共衛(wèi)生事件時(shí)，快速準(zhǔn)確的判斷病原菌，成為診療的關(guān)鍵。雖然傳統(tǒng)的沙門氏菌檢測方法本身證明是可靠的，但卻很費(fèi)力、耗時(shí)，需要4～7 d才能完成。而近幾年發(fā)展起來的膠體金免疫快速檢測法，是利用抗體膠體金標(biāo)記技術(shù)和膜層析技術(shù)研制而成，用于定性檢測標(biāo)本中的沙門氏菌。該法操作簡單，檢測結(jié)果清晰，易于判斷，可廣泛應(yīng)用于臨床和基層醫(yī)療單位對可疑沙門氏菌標(biāo)本的快速檢測[1-4]。為了探討快速法在臨床標(biāo)本中的使用價(jià)值，我們對自制的沙門氏菌免疫膠體金試紙條與培養(yǎng)方法進(jìn)行比較，并對檢測結(jié)果進(jìn)行分析，以確定其在沙門氏菌引起腹瀉的診斷價(jià)值，以滿足臨床需要。

1 材料與方法

1.1 試劑 SS、EMB購自購自北京市陸橋技術(shù)有限公司。沙門氏菌診斷血清購自寧波天潤生物藥業(yè)有限公司。細(xì)菌生化鑒定板購自珠海迪爾生物工程有限公司。細(xì)菌生化鑒定儀購自珠海迪爾生物工程有限公司。沙門氏菌免疫層析條由本實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 標(biāo)本 標(biāo)本為2011年5月至 2012年10月間，我院門診和病房腹瀉患者糞便標(biāo)本共520例。其中男性患者300例,女性220例；年齡7～75歲,平均年齡35歲。

1.3 方法

1.3.1 培養(yǎng)方法：取糞便標(biāo)本接種到SS、EMB培養(yǎng)基上，35℃培養(yǎng)18～24 h，挑取可疑菌落，分離純化，同時(shí)做初步鑒定，同時(shí)用沙門氏菌多價(jià)血清(A-F)群進(jìn)行分群，最后用純化的菌做生化鑒定，用沙門氏菌診斷血清鑒定到種。

1.3.2 沙門氏菌免疫層析條檢測[5-7]：取1 g(1 ml)標(biāo)本加9 ml0.9%氯化鈉溶液混勻，500×g離心5 min。吸取上清液加入另一滅菌離心管中以14 000×g，離心10 min，沉淀用500 ml0.9%氯化鈉溶液懸浮 。在沸水中煮沸半小時(shí)。然后再用沙門氏菌免疫層析條檢測。實(shí)驗(yàn)設(shè)陰陽性對照，以生理鹽水為陰性對照，結(jié)果判讀，檢測線和質(zhì)控線同時(shí)出現(xiàn)為陽性，只出現(xiàn)質(zhì)控線，為陰性，只出現(xiàn)檢測線，而無質(zhì)控線，需重做。用培養(yǎng)的方法和免疫膠體金法同時(shí)對520例標(biāo)本進(jìn)行檢測，以培養(yǎng)法為標(biāo)準(zhǔn)，對檢測結(jié)果進(jìn)行對比分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件，用四格表評價(jià)免疫膠體金法檢測的敏感性、特異性和準(zhǔn)確性，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)比較，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 用培養(yǎng)的方法和免疫膠體金法同時(shí)對520例標(biāo)本進(jìn)行檢測，其中培養(yǎng)的方法檢出11例陽性標(biāo)本,509例陰性標(biāo)本,而用免疫膠體金法檢測出9份陽性標(biāo)本, 511例陰性標(biāo)本。見表1。

獨(dú)立性檢驗(yàn)(pearsonx2檢驗(yàn))結(jié)果：N=520，pearsonx2=94．214，P=0.000，兩種沙門氏菌檢測方法的結(jié)果不獨(dú)立，說明兩種檢測方法所得結(jié)果之間具有關(guān)聯(lián)性，其列聯(lián)系數(shù)中為0.903，可認(rèn)為兩種檢測結(jié)果之間存在正關(guān)聯(lián)性；Kappa值為0.898，表明兩種方法的檢測結(jié)果之間的一致性為優(yōu)。

表1 免疫膠體金法檢測的結(jié)果與培養(yǎng)方法比較

配對設(shè)計(jì)的Mc Nemerx2檢驗(yàn)結(jié)果Mc Nemerx2P值為0.500，因此認(rèn)為膠體金法診斷沙門氏菌與金標(biāo)準(zhǔn)方法檢測結(jié)果之間的差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 常用診斷試驗(yàn)評價(jià)指標(biāo)的計(jì)算結(jié)果 自制沙門氏菌免疫膠體金試紙條的特異性為100%，靈敏度為81.8%。Youden指數(shù)越接近1，說明其診斷價(jià)值越大，本試劑的Youden指數(shù)為 81.8%，說明其診斷價(jià)值比較高。該試紙條與培養(yǎng)方法相比符合率達(dá)到99.6%。見表2。

表2 膠體金法診斷沙門氏菌試驗(yàn)的評價(jià)指標(biāo)

3 討論

通過實(shí)驗(yàn)可知自制沙門氏菌膠體金試紙條與培養(yǎng)方法相比較其診斷的靈敏度為81.8%，特異性為100%，假陽性率為0；假陰性率為18.2%，符合率達(dá)到99.6%。

目前，對于沙門氏菌有很多檢測方法，如免疫學(xué)方法、分子生物學(xué)方法、以及傳統(tǒng)的金標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)方法。但是，在應(yīng)對突發(fā)公共衛(wèi)生事件時(shí)，快速準(zhǔn)確的判斷病原菌，成為診療的關(guān)鍵。雖然傳統(tǒng)的沙門氏菌檢測方法本身證明是可靠的，但卻很費(fèi)力、耗時(shí)，需要4～7 d才能完成，已不能達(dá)到令人滿意的效果。分子生物學(xué)方法，雖然靈敏度高，可是操作繁瑣，技術(shù)性強(qiáng)，對人員要求嚴(yán)格，也不適合現(xiàn)場大規(guī)模應(yīng)用，而免疫膠體金技術(shù)，以其操作簡單、檢測時(shí)間短、不需專業(yè)培訓(xùn)就能滿足檢測的特點(diǎn)，非常適合突發(fā)公共衛(wèi)生事件時(shí)，快速檢測目的。但是該方法靈敏度低，受方法學(xué)限制，從方法學(xué)上提高靈敏度，不太可能，所以在臨床標(biāo)本檢測中，能不能通過建立一套前處理方法，以達(dá)到去除影響因子，提高靈敏度的目的呢？本研究使用自制沙門氏菌免疫膠體金試紙條，對糞便標(biāo)本進(jìn)行檢測，同時(shí)，實(shí)驗(yàn)將密度梯度離心法和煮沸處理相結(jié)合，采用密度梯度離心法，去除了糞便中大部分的顆粒物，再經(jīng)過煮沸處理，菌體破裂，暴露的抗體結(jié)合位點(diǎn)增多，并且顆粒變小后，在纖維素膜上的涌動(dòng)速度變快，從而大大提高了陽性檢出時(shí)間和檢出限，整個(gè)檢測時(shí)間在一小時(shí)內(nèi)完成，基本能滿足突發(fā)公共衛(wèi)生事件的要求，達(dá)到快速、準(zhǔn)確的檢測目的[10，11]。

膠體金方法作為一種免疫學(xué)方法具有快捷迅速，大大縮短出結(jié)果時(shí)間；操作簡便，不需任何儀器和設(shè)備；試劑穩(wěn)定，外界因素影響較小；成本低廉，所需試劑和樣本量少的特點(diǎn)越來越受到科學(xué)家的關(guān)注，并成功應(yīng)用于一些臨床檢測。但是在應(yīng)用中也暴漏出一個(gè)問題，那就是通過計(jì)算發(fā)現(xiàn)膠體金法診斷沙門氏菌的靈敏度為81.8%，靈敏度則有待提高，容易造成漏診。所以在實(shí)際工作中只能做為輔助方法，不能代替培養(yǎng)的方法，在今后的工作中，我們將尋求改進(jìn)的方法提高其靈敏度。

1 諶志強(qiáng)，段惠莉，王新為，等．大腸埃希菌O157：H7的膠體金免疫滲濾法檢測．中國公共衛(wèi)生, 2005，21：705-706．

2 Duan HL，Shen ZQ，Wang XW，et al．Preparation of immunomagnetic iron-dextran nanoparticles and application in rapid isolation of E.coli O157 from foods．J World Journal of Gastroenterology，2005，11：3660-3664．

3 王中民，李君文，王新為，等．膠體金免疫層析法快速檢測沙門氏菌.微生物學(xué)免疫學(xué)進(jìn)展，2004，32：36-38．

4 唐景峰,李曉艷.布病膠體金免疫層析檢測方法的建立.中國生物制品學(xué)雜志,2007,20:119-122.

5 熊國華，于莉.單增李斯特菌免疫膠體金試紙條快速檢測.中國公共衛(wèi)生,2008,24:248-249.

6 賈慧，田秀梅.膠體金快速法檢測糞便幽門螺桿菌分泌蛋白的臨床應(yīng)用評價(jià).吉林醫(yī)學(xué),2009,30:2629-2630.

7 王璞，陳保文.斑點(diǎn)免疫金滲濾法檢測抗莢膜組織胞漿茵抗體的研究.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2007,29:1979-1981.

8 李少彤，欒玉明.膠體金法快速檢測霍亂弧菌診斷試驗(yàn)的研究設(shè)計(jì)與分析.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志,2006,16:269-271.

9 許青田,崔中鋒.膠體金標(biāo)記免疫層析法快速診斷霍亂臨床研究.中國誤診學(xué)雜志,2002,2:900-901.

10 劉景武，付素蘭，任天紅，等.沙門氏菌膠體金免疫層析試紙條檢測腹瀉病人糞便中沙門氏菌的研究.中國衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2014，24:66-67.

11 劉景武，付素蘭，任天紅，等.沙門氏菌膠體金免疫層析試紙條的研制.河北醫(yī)藥，2013，35:3493-3494.

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050011 河北省石家莊市第三醫(yī)院檢驗(yàn)科

R 378.22

A

1002-7386(2014)07-1021-02

2013-10-30)