烏司他丁對大鼠創(chuàng)傷性腦水腫后NF-κB及IL-1β表達的影響

都義日 杜雪江 于建設

·論著·

烏司他丁對大鼠創(chuàng)傷性腦水腫后NF-κB及IL-1β表達的影響

都義日 杜雪江 于建設

目的通過觀察大鼠創(chuàng)傷性腦水腫后腦組織中核轉(zhuǎn)錄子-κB(NF-κB)及白介素-1β(IL-1β)的變化，探討烏司他丁(UTI)在大鼠創(chuàng)傷性腦水腫過程中對腦組織的保護作用及其機制。方法將30只健康成年SD大鼠隨機分為正常對照組、創(chuàng)傷性腦水腫組及UTI干預組，每組10只。并于傷后8、24、72采用免疫組化法及血清ELISA法檢測腦組織NF-κB和IL-1β的水平。結(jié)果創(chuàng)傷性腦水腫組和UTI組腦水腫部位NF-κB的活性和IL-1β的水平均較對照組明顯升高(P<0.01)，且于24 h達到最高值，于72 h時有所下降；UTI組各時間點與創(chuàng)傷性腦水腫組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。結(jié)論烏司他丁對大鼠創(chuàng)傷性腦水腫引起的腦損傷具有明顯的腦保護作用，通過抑制NF-κB和IL-1β信號傳導通路是烏司他丁腦保護作用的重要機制之一。

烏司他丁 ；腦保護；核轉(zhuǎn)錄因子-κB；白介素-1β

創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)后，在原發(fā)的腦損傷的基礎上發(fā)生于細胞水平上的繼發(fā)性腦損害可造成難以逆轉(zhuǎn)的神經(jīng)功能損害。包括興奮性損害、鈣平衡的改變、自由基損害、炎性反應及細胞凋亡等。其中炎性介質(zhì)是參與許多顱腦損傷后腦水腫形成的重要因素之一。因此，如何通過抑制炎癥介質(zhì)的釋放，減輕腦損傷后炎性反應，從而降低神經(jīng)功能障礙的發(fā)生越來越多的受到關(guān)注。烏司他丁(Ulinastatin，UTI)作為一種蛋白酶抑制劑，研究表明，UTI可通過抑制NF-κB的活性來抑制炎性介質(zhì)的釋放，從而發(fā)揮腦保護作用[1]。本研究通過觀察大鼠創(chuàng)傷性腦水腫后腦組織中核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)及IL-1β的變化，探討UTI在大鼠創(chuàng)傷性腦水腫過程中對腦組織的保護作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 選擇SD大鼠30只，雌雄不拘，體重300～350 g。按照隨機數(shù)字表分為正常對照組、創(chuàng)傷性腦水腫組及UTI干預組，每組10只。UTI治療組預先靜脈給予5×104U/kg ；其余兩組給予等量0.9%氯化鈉溶液。

1.2 模型制作 在室溫條件下，用戊巴比妥(40 mg/kg)麻醉后，固定于腦立體定向儀上，頭頂剪毛，常規(guī)消毒。采用Marmarou等[2]創(chuàng)立的自由落體撞擊法制作。于大鼠麻醉后，切開頭皮，暴露頂骨，以牙科樹脂將直徑10 mm、厚3 mm的金屬頭盔牢固粘于頂骨前、后囟之間。以450 g砝碼自1.5 m高度自由落下，建立創(chuàng)傷性腦水腫模型。

1.3 指標的測定

1.3.1 腦組織NF-κB的測定：3組分別于傷后8、24、72 h 3個時間點橫斷大鼠脊髓，取出腦組織并用4%多聚甲醛液固定后，梯度酒精脫水、二甲苯透明、浸焟，常規(guī)石蠟包埋，切片。采用免疫組化染色檢測NF-κB活性。以水腫部位周圍胞漿/胞核中出現(xiàn)棕色顆粒為陽性細胞，并測定陽性細胞的平均光密度值。

1.3.2 大鼠腦組織IL-1β水平測定：3組分別于傷后8、24、72 h3個時間點取0.2 ml腦組織勻漿上清液和血清，采用放射免疫法測定IL-1β。

2 結(jié)果

2.1 創(chuàng)傷性腦水腫后各組NF-κB活性的影響 創(chuàng)傷性腦水腫組和UTI組腦水腫部位NF-κB的活性較對照組明顯升高(P<0.01)，且于24 h達高峰，于72 h時有所下降；在觀察的時間點里，UTI組各時間點均與創(chuàng)傷性腦水腫組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表1。

表1 創(chuàng)傷性腦水腫后3組NF-κB活性的變化

表1 創(chuàng)傷性腦水腫后3組NF-κB活性的變化

組別8h24h72h對照組0.057±0.0050.048±0.0060.061±0.007創(chuàng)傷性腦水腫組0.211±0.009*0.343±0.018*0.268±0.012*UTI組0.176±0.007*#0.250±0.010*#0.201±0.009*#

注：與對照組比較，*P<0.01；與創(chuàng)傷性腦水腫組比較，#P<0.01

2.2 創(chuàng)傷性腦水腫后各組IL-1β水平 創(chuàng)傷性腦水腫組和UTI組腦水腫部位IL-1β水平較對照組明顯升高(P<0.01)，且于24 h達高峰；在觀察的時間點里，UTI組各時間點均與創(chuàng)傷性腦水腫組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。見表2。

表2 創(chuàng)傷性腦水腫后3組IL-1β水平的變化

表2 創(chuàng)傷性腦水腫后3組IL-1β水平的變化

組別8h24h72h對照組0.090±0.0070.085±0.0060.092±0.008創(chuàng)傷性對照組0.257±0.011*0.331±0.015*0.290±0.013*UTI組0.199±0.009*#0.228±0.012*#0.201±0.010*#

注：與對照組比較，*P<0.01；與創(chuàng)傷性腦水腫組比較，#P<0.01

3 討論

腦水腫是過多的水分積聚在腦實質(zhì)內(nèi)造成大腦腫脹的疾病，是顱腦損傷后較常見的繼發(fā)損傷。腦水腫引發(fā)的顱內(nèi)壓增高、腦疝將進一步加重神經(jīng)功能損害，是顱腦損傷后治療的關(guān)鍵所在。傳統(tǒng)治療方法針對腦水腫主要干預措施是給予甘露醇等脫水或行去骨瓣減壓術(shù)[3]，但均存在不同程度的副作用。為了能夠達到靶點治療的目標，研究人員著力于探討創(chuàng)傷性腦水腫的發(fā)生機制，并尋找到更有效而又副作用少的治療方法。

研究發(fā)現(xiàn)，在創(chuàng)傷性腦損傷后，損傷的部位浸潤各種炎性細胞，并分泌大量的炎性細胞因子，繼而在炎性細胞因子的作用下：一方面作為保護性機制誘導神經(jīng)修復和重建的同時炎性細胞因子作為損害因素，進一步加重腦水腫和神經(jīng)細胞的損害，并引起一系列的級聯(lián)反應加重神經(jīng)系統(tǒng)的破壞。創(chuàng)傷性腦水腫的炎性反應由一系列炎性細胞因子參與，其中包括IL-1β、IL-6、IL-8、腫瘤壞死因子(TNF-α)、熱休克蛋白(HSP)等。在白介素家族中，IL-1β與腦損傷關(guān)系最為密切。IL-1β是單核巨噬細胞合成和分泌的急性炎性因子，它通過促進炎癥作用可激活腦內(nèi)的小膠質(zhì)細胞，促進白細胞和內(nèi)皮細胞的黏附而激發(fā)炎性反應從而破壞血腦屏障[4]。IL-1β在腦損傷的早期就可以顯著升高，介導中性粒細胞向內(nèi)皮細胞滾動、黏附、滲透并造成腦水腫和急性炎性反應。在創(chuàng)傷性腦損傷后，NF-κB的激活、白介素和TNF-α的表達將共同參與并加重神經(jīng)系統(tǒng)功能的損害的過程[5，6]。

NF-κB是調(diào)控炎性介質(zhì)釋放的細胞內(nèi)核轉(zhuǎn)錄因子。NF-κB是目前發(fā)現(xiàn)的與炎癥有關(guān)的重要轉(zhuǎn)錄因子之一，是多種信號傳導途徑的匯聚點，在調(diào)節(jié)創(chuàng)傷性腦水腫后炎癥反應中誘導多種細胞因子和趨化因子的表達，并對多種關(guān)鍵酶的表達[7]具有重要的調(diào)控作用。靜息狀態(tài)下，NF-κB以非共價鍵結(jié)核的方式與其抑制因子I kB相結(jié)合，以無活性的形式存在于胞漿。在IL-1β、TNF-α、內(nèi)毒素等刺激因素作用下被激活后，NF-κB被磷酸化，并被蛋白酶水解，從而使NF-κB進入細胞核內(nèi)，并開始啟動和調(diào)控一系列細胞因子和黏附分子的表達[8]。與此同時，由NF-κB調(diào)節(jié)生成的產(chǎn)物如IL-1β、TNF-α、內(nèi)毒素等將繼續(xù)激活 NF-κB，從而形成級聯(lián)瀑布效應。越來越多的研究證實NF-κB的激活是炎性介質(zhì)釋放后炎癥反應失控的重要步驟[7-9]。因此，如何抑制NF-κB的激活成為阻止炎性反應發(fā)生并引起一系列腦損傷的治療關(guān)鍵所在。

目前研究表明，如何在早期抑制細胞因子和有害物質(zhì)的生成是治療顱腦損傷的重點[8]。烏司他丁(UTI)作為一種蛋白酶抑制劑，近年來越來越多的被用于腦保護作用的研究當中[9]。UTI主要通過清除氧自由基、抑制炎性反應，免疫調(diào)節(jié)等方面發(fā)揮器官保護作用。本研究通過UTI治療創(chuàng)傷性腦水腫后發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷性腦水腫組和UTI組腦水腫部位NF-κB的活性和IL-1β的水平均較對照組明顯升高(P<0.01)，且于24 h達到較高值，于72 h時有所下降；在觀察的時間點里，UTI組各時間點均與創(chuàng)傷性腦水腫組比較差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。說明經(jīng)UTI治療組NF-κB活性和IL-1β的水平均較創(chuàng)傷性腦水腫組明顯降低。通過本研究發(fā)現(xiàn)UTI對NF-κB和IL-1β均具有明顯的抑制作用，進而減輕炎性反應、穩(wěn)定細胞膜，保護血腦屏障的結(jié)構(gòu)和功能，從而起到減少神經(jīng)系統(tǒng)的功能損害的作用。

本實驗通過對創(chuàng)傷性腦水腫后NF-κB和IL-1β水平的變化及UTI對其進行干預后的影響的觀察，探討UTI對創(chuàng)傷性腦水腫后炎癥反應的保護作用，發(fā)現(xiàn)UTI可通過抑制NF-βB表達，進一步抑制炎性細胞因子如IL-1β、IL-6、TNF-α等的表達，從而有效的保護腦細胞，減輕腦水腫，顯著減輕繼發(fā)性腦損傷，并為創(chuàng)傷性腦水腫的臨床治療提供了新思路。

1 陳偉峰，劉德紅，何衛(wèi)平，等.烏司他丁對大鼠全腦缺血再灌注后NF-κB 的影響.廣西中醫(yī)學院學報，2006，9:11-14.

2 Marmarou A,Foda MA,van den Brink W,et al.A new model of diffuse brain injury in rats.Part I:Pathophysiology and biomechanics.J Neurosurg,1994,80:291-300.

3 Scaife ER,Statler KD.Traumatic brain injury :preferred methods and targets for resuscitation.Curr Opin Pediatr,2010,22:339-345.

4 Chen B,Liao WQ，Xu N，et al．Adiponectin protects against cerebral ischemia- reperfusion injury through anti-inflammatory action．Brain Res，2009，1273：129-137．

5 Hang CH，Shi JX,Li JS，et al．Concomitant upregulation of nuclear factor-κB activity，proinflammatory cytokines and ICAM-1 in the injured brain after cortical contusion trauma in a rat model．Neurology India，2005，53：312-317．

6 Hang CH,Shi JX,Li JS，et al．Up-regulation of intestinal nuclear factor kappa B and intercellular adhesion molecule-1 following traumatic brain injury in rats．Word JGastroenterol,2005,11：1149-1154.

7 Goebeler M,Gillitzer R,Kilian K,et al.Multiple signaling pathways regulate NF-Kappa B-dependent transcription of the monocyte chemoattractant protein-1 gene in primary endothelial cell.Blood,2001,97:46-55.

8 Iha H,Peloponese JM，Verstrepen L,et al．Inflammatory cardiac valvulitis in TAXlBPI-deficient mice through selective NF-kappa B activation．EMBO J,2008,27：629-641．

9 于熙,田國剛,田毅.烏司他丁的腦保護作用研究進展.海南醫(yī)學院學報，2010,16 ：948-950.

Effect of ulinastatin on the expression of nuclear factor-κB and interleukin-1β in rats with traumatic encephaledema

DUYiri,DUXuejiang,YUJianshe.DepartmentofAnesthesia,AffiliatedHospitalofInnerMongoliaMedicalUniversity,Hohhot010050,China

ObjectiveTo observe the changes of expression levels of nuclear factor-κB (NF-κB) and interleukin-1β (IL-1β) in rats with traumatic encephaledema in order to explore the protective effect and possible action mechanism of ulinastatin(UTI).MethodsThirty healthy adults SD 30 rats were randomly divided into three groups:normal control group,traumatic encephaledema group and UTI intervention group.The levels of NF-κB and IL-1β in serum and brain tissue homogenate (BTH) were detected by immunohistochemisty and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) at the 8th,12th,24th,72th hour after trauma.ResultsThe levels of NF-κB and IL-1β in encephaledema position were significantly increased,as compared with those in control group (P<0.01),which reached peak at the 24th hour,however,which reduced slightly at the 24th hour;there were significant differences in the changes of levels of NF-κB and IL-1β in every time point between UTI group and traumatic encephaledema group(P<0.01).ConclusionUTI has obvious protective effect on the brain injury caused by traumatic encephaledema in rats,it may be one of the action mechanisms to inhibit the signal transduction way of NF-κB and IL-1β.

ulinastatin;protection brain；NF-κB ;interleukin-1β

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.07.006

項目來源：內(nèi)蒙古醫(yī)科大學青年基金資助項目(編號：NY2011QN004)

010050 呼和浩特市，內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院麻醉科

R 742

A

1002-7386(2014)07-0981-03

2013-10-25)