圍刺配合電針對乳腺增生大鼠血清激素水平和乳腺組織形態(tài)、ER表達(dá)的影響

荊榮霞 梁立紅 李霞 肖紅玲 張拴成 佘延芬

·論著·

圍刺配合電針對乳腺增生大鼠血清激素水平和乳腺組織形態(tài)、ER表達(dá)的影響

荊榮霞 梁立紅 李霞 肖紅玲 張拴成 佘延芬

目的觀察圍刺配合電針對乳腺增生大鼠血清性激素雌與孕激素的比值(E2/P)、泌乳素(PRL)、睪酮(T)、乳腺組織形態(tài)和乳腺組織ER表達(dá)的影響，以探討干預(yù)治療乳腺增生的作用機(jī)制。方法隨機(jī)將40只Wistar大鼠分為模型組、針刺組、三苯氧胺組及正常組，每組10只。采用己烯雌酚聯(lián)合黃體酮肌內(nèi)注射進(jìn)行造模。針刺組：將大鼠固定，分別圍刺第2對左右乳房后，接通電針儀持續(xù)刺激30 min，并針刺膻中穴，留針30 min；三苯氧胺組予三苯氧胺1.8 mg/kg灌胃治療，1次/d，共30 d。于末次治療后測定血清E2、P、PRL、T含量，計(jì)算E2/P比值；取大鼠第2對乳房常規(guī)HE染色，光鏡下觀察組織形態(tài)表現(xiàn)；運(yùn)用免疫組化法對乳房乳腺組織中ER表達(dá)情況進(jìn)行觀察。結(jié)果治療后E2/P：針刺組與三苯氧胺組比值均低于模型組(P<0.05)。PRL：針刺組和三苯氧胺組均低于模型組(P<0.05)；針刺組與三苯氧胺組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。T：針刺組和三苯氧胺組均低于模型組(P<0.05)。乳腺組織ER表達(dá)：針刺組和三苯氧胺組大鼠乳腺組織ER陽性細(xì)胞表達(dá)情況顯著降低， AOD值低于正常組(P<0.05)。結(jié)論圍刺配合電針具有降低模型大鼠乳頭高度、縮小乳頭直徑，改善血清E2/P、PRL、T紊亂狀態(tài)和乳腺組織病理形態(tài)，降低乳腺增生模型大鼠乳腺組織ER表達(dá)的作用。

圍刺配合電針；乳腺纖維囊性??；雌孕激素比值；泌乳素；睪酮；乳腺組織形態(tài)；ER表達(dá)；大鼠

乳腺增生臨床癥狀以乳房腫塊和疼痛為主，又可稱為乳腺結(jié)構(gòu)不良。隨著當(dāng)今社會女性工作、生活壓力日趨增大，伴隨晚婚晚育，導(dǎo)致產(chǎn)后缺乳，從而誘使本病發(fā)病呈逐年上升趨勢。經(jīng)流行病學(xué)統(tǒng)計(jì)顯示，乳腺增生可有一定的癌變幾率，致使本病的治療引起高度重視[1]。采用圍刺配合電針的方法治療乳腺增勢，是本課題組人員經(jīng)多年臨床實(shí)踐而總結(jié)出的有效方法，為進(jìn)一步探討此方法的具體作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)觀察其對乳腺增生大鼠第2對乳頭的高度和直徑、血清雌孕激素比值E2/P比值、泌乳素(PRL)、睪酮(T)、乳腺組織病理形態(tài)、ER表達(dá)的影響，旨在為有效預(yù)防與治療本病提供理論指導(dǎo)和實(shí)驗(yàn)支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動物：選用河北醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心提供的清潔級3月齡雌性未孕健康Wistar大鼠40只(動物合格證號：903092)，體重(230±20)g。飼養(yǎng)條件：溫度20～26℃，明暗各12 h，清潔級動物實(shí)驗(yàn)室，室內(nèi)采光和通風(fēng)均良好，自由飲水與進(jìn)食，喂飼大鼠普通飼料(河北醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供)。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)藥物：己烯雌酚：天津金耀氨基酸有限公司， 1 ml/0.5 mg；三苯氧胺：揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司，并用蒸餾水將其配制成混懸液；黃體酮：天津金耀氨基酸有限公司，1 ml/10 mg。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器：ER抗體由SantaCru2公司分裝；ER免疫組化檢測試劑盒，北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；125I泌乳素放射免疫分析藥盒、125I雌二醇放射免疫分析藥盒、125I睪酮放射免疫分析藥盒、125I孕酮放射免疫分析藥盒，均為天津九鼎醫(yī)學(xué)生物工程有限公司；TDL-5-A型離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；FJ-2021型γ-放射免疫計(jì)數(shù)器，西安二六二廠；HMIAS-2000顯微圖像分析系統(tǒng)，武漢同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)；SHB-D循環(huán)水真空泵，鄭州長城；Citadel-2000包埋機(jī)，英國姍頓公司；2035型LEICA切片機(jī)，德國。

1.2 方法

1.2.1 分組及造模方法：隨機(jī)將40只大鼠分為模型組、針刺組、三苯氧胺組和正常組，每組10只。除正常組外，其余3組均肌內(nèi)注射己烯雌酚注射液0.5 mg/kg，1次/d，連續(xù)25 d，然后肌內(nèi)注射黃體酮4 mg/kg，1次/d，連續(xù)5 d，建立大鼠乳腺增生模型，注射位置均選取大鼠右下肢外側(cè)[1，2]。正常組于大鼠右下肢外側(cè)肌內(nèi)注射0.9%氯化鈉溶液，1次/d，連續(xù)30 d。

1.2.2 治療方法：造模成功后，①針刺組：采用自制束鼠器將實(shí)驗(yàn)大鼠固定，分別圍刺其第2對乳房，具體位置是以乳頭為中心，距乳頭3 mm的半徑圓上面3、6、9、12點(diǎn)處，選用φ0.25×13 mm毫針向內(nèi)(乳頭方向)平刺3 mm左右，針刺后即接通G6805-2A型電針儀，取疏密波(密波80 Hz、疏波50 Hz)，頻率12次/min，強(qiáng)度1～2 mA，以針柄微顫動且大鼠能耐受不掙扎撕咬為度，同時(shí)膻中穴向下平刺，進(jìn)針約3 mm，留針30 min。②三苯氧胺組：參考文獻(xiàn)[3]，三苯氧胺1.8 mg/kg灌胃。③其余3組均采用針刺組同法僅將大鼠固定30 min。④其余3組均采用與三苯氧胺組同體積的蒸餾水給大鼠灌胃。4組干預(yù)方法均為1次/d，連續(xù)30 d。

1.2.3 取材與檢測方法：4組大鼠末次治療結(jié)束后，不禁水但禁食12 h，后斷頭取血。所取血樣離心(2 000 r/min，15 min)，所得血清置于-70℃冰箱保存?zhèn)溆?。同批測定血清E2、P、PRL、T含量嚴(yán)格按放射免疫分析測定分析試劑盒說明書操作，同時(shí)計(jì)算E2/P比值。無菌條件下取4組大鼠第2對乳房，4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋切片，常規(guī)HE染色，光鏡下觀察所取4組乳腺組織的形態(tài)表現(xiàn)。免疫組化法檢測大鼠第2對乳房乳腺組織中ER表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 圍刺配合電針對大鼠血清E2/P比值的影響 模型組血清E2/P比值明顯高于正常組 (P<0.05)；針刺組和三苯氧胺組均低于模型組 (P<0.05)；針刺組與三苯氧胺組比較，有下降趨勢，更接近正常組，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2 圍刺配合電針對大鼠血清PRL含量的影響 模型組明顯高于正常組 (P<0.05)；針刺組和三苯氧胺組均低于模型組 (P<0.05)；針刺組與三苯氧胺組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.3 圍刺配合電針對大鼠血清T含量的影響 模型組明顯高于正常組 (P<0.05)；針刺組和三苯氧胺組均低于模型組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；針刺組與三苯氧胺組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 治療后4組大鼠血清中E2/P和PRL、T含量比較

2.4 圍刺配合電針對大鼠乳腺組織病理學(xué)的影響 光鏡下，造模好的乳腺增生大鼠乳腺組織中乳腺小葉、腺泡以及腺導(dǎo)管數(shù)均增加，腺泡腔和腺導(dǎo)管擴(kuò)張明顯，腔內(nèi)分泌物多，上皮細(xì)胞排列紊亂且增生明顯。干預(yù)治療后模型組與正常組比較，與上述結(jié)果相同。針刺組、三苯氧胺組與模型組比較，上述情況有明顯改善，乳腺小葉、腺泡和腺導(dǎo)管數(shù)可見減少，腺泡腔及腺導(dǎo)管萎縮，腔內(nèi)分泌物亦有所減少，上皮細(xì)胞排列較規(guī)則，均與正常組相似。見圖1～4。

圖1 正常組大鼠乳腺組織病理學(xué)(HE×100)

圖2 模型組大鼠乳腺組織病理學(xué)(HE×100)

圖3 三苯氧胺組大鼠乳腺組織病理學(xué)(HE×100)

圖4 針刺組大鼠乳腺組織病理學(xué)(HE×100)

圖5 正常組ER蛋白表達(dá)(IHC×100)

圖6 模型組ER蛋白表達(dá)(IHC×100)

圖7 三苯氧胺組ER蛋白表達(dá)(IHC×100)

圖8 針刺組ER蛋白表達(dá)(IHC×100)

2.5 圍刺配合電針對大鼠ER蛋白表達(dá)的影響 光鏡下觀察ER陽性細(xì)胞，胞核呈黃色或棕黃色。模型組乳腺組織ER陽性細(xì)胞明顯增多，AOD明顯高于正常組 (P<0.05)；針刺組和三苯氧胺組均低于模型組(P<0.05)；針刺組與三苯氧胺組相比存在下降趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2，圖5～8。

表2 治療后4組大鼠乳腺ER(AOD)比較

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)傳統(tǒng)認(rèn)為乳腺是多種內(nèi)分泌激素的靶器官，并由此推測造成乳腺增生的主要原因可能是體內(nèi)E2絕對(相對)增多，加之體內(nèi)P長時(shí)間不足，引起E2/P比值失調(diào)，致使乳腺實(shí)質(zhì)增生過度或(和)復(fù)舊不全[4]。PRL是由垂體遠(yuǎn)側(cè)部的嗜酸性細(xì)胞產(chǎn)生，可在E2、P的共同調(diào)節(jié)作用下對乳腺的生長發(fā)育起推動作用，并能維持和促進(jìn)泌乳功能。體內(nèi)少量T可以促進(jìn)乳腺發(fā)育，而大量T反而會抑制乳腺發(fā)育[5]。E2通過與特異性ER結(jié)合來發(fā)揮其生理作用，E2的最終響應(yīng)不單取決于它本身的分泌與代謝，還與ER的表達(dá)水平及功能發(fā)揮密切相關(guān)[6,7]，乳腺組織中出現(xiàn)ER升高，對E2的敏感性增長，是乳腺組織增生發(fā)生發(fā)展的重要原因[8]，故觀察E2/P比值及各激素水平對判定療效具有特殊意義。參考大鼠解剖圖譜和實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)等相關(guān)資料，我們選擇大鼠第2對乳房為目標(biāo)器官，因其與人類乳房的位置接近，同時(shí)適宜針刺操作，故選其作為針刺治療及觀察乳腺組織形態(tài)、ER蛋白表達(dá)的對象。

乳腺增生屬中醫(yī)“乳癖”范疇。足厥陰肝經(jīng)、足陽明胃經(jīng)循行過乳房部，依“經(jīng)脈所過，主治所及”，古今乳病多歸責(zé)于肝和胃。課題組根據(jù)多年臨床經(jīng)驗(yàn)認(rèn)為乳腺增生的發(fā)病主要與肝氣不舒、沖任失調(diào)相關(guān)。當(dāng)今社會女性工作、生活壓力日趨增大，常有肝氣郁結(jié)，而木克土，故又可克犯脾胃，從而可導(dǎo)致氣滯血瘀，津凝成痰，阻于乳絡(luò)，以至形成腫塊；又有沖任二脈失和，下可使胞宮經(jīng)水逆亂，上可使乳房氣血凝滯，最終發(fā)為乳腺增生[9,10]。本病隨月經(jīng)周期呈現(xiàn)動態(tài)變化過程，氣滯、血瘀、痰濁在病理狀態(tài)下形成惡性循環(huán)，而成痼疾?；趯θ橄僭錾∫虿C(jī)的獨(dú)特認(rèn)識，治療理念立足氣、血、痰辨治，以理氣化痰、調(diào)理沖任、消瘀散結(jié)為法，另特?cái)M圍刺配合電針而治療，臨床效果頗佳。

圍刺，源于《靈樞·官針》中的揚(yáng)刺法，是指多針刺向病變中心，形似圍剿敵寇之狀，屬局部多針刺法范疇，臨床應(yīng)用較為廣泛，常用于局限性腫塊、結(jié)節(jié)、麻木、疼痛等病證的治療[11]，具有疏通經(jīng)絡(luò)、祛瘀消腫、軟堅(jiān)散結(jié)的作用。本研究中對乳腺增生大鼠第2對乳房施行圍刺，所取之處均為肝、脾、胃三經(jīng)循行區(qū)域，可起到疏肝理氣、和胃化痰、通調(diào)乳絡(luò)、消瘀散結(jié)的作用。膻中穴屬任脈，為心包募穴，是任脈、手太陽、手少陽、足太陰、足少陰經(jīng)的交會穴，又是宗氣聚會之處，即氣之會穴，刺之有寬胸理氣，活血通絡(luò)，消瘀散結(jié)，調(diào)理沖任的作用。

電針療法，是在針刺后得氣的基礎(chǔ)上通過電流刺激替代行針手法，對腧穴產(chǎn)生刺激從而治療疾病的一種方法[12]，本實(shí)驗(yàn)選用電針中具有促進(jìn)局部氣血循環(huán)，改善組織營養(yǎng)、消除炎癥水腫作用的疏密波型，將傳統(tǒng)針刺療法與電物理技術(shù)有機(jī)結(jié)合，產(chǎn)生了針刺和電刺激的雙重治療作用。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，圍刺配合電針可明顯調(diào)節(jié)血清E2/P比值，同時(shí)降低血清PRL、T水平，從而改善乳腺增生模型大鼠的內(nèi)分泌紊亂，明顯改變?nèi)橄俳M織病理形態(tài)，與文獻(xiàn)報(bào)道[13-15]一致。其降低乳腺增生大鼠乳腺組織中ER表達(dá)，抑制ER與E2的結(jié)合，減少E2對乳腺的作用，是圍刺配合電針治療乳腺增生的作用機(jī)制之一。

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9 李彪，龔景林主編.新編中醫(yī)外科學(xué).第1版.北京：人民軍醫(yī)出版社，1999.294-299.

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11 陸壽康主編.針刺手法百家集成.北京：中國中醫(yī)藥出版社，1995.270-271.

12 林文注，王佩主編.實(shí)驗(yàn)針灸學(xué).第1版.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1999.215.

13 李衛(wèi)民，李廷冠，易自剛，等.乳腺康膠囊對實(shí)驗(yàn)性乳腺增生病的病理觀察.江蘇中醫(yī)藥，2006，27：56-57.

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The effect of Weici combined with electric acupuncture on the expression levels of E2 /P ,prolactin,testosterone,ER and mammary gland tissue morphous in rats with mammary gland hyperplasia

JINGRongxia*,LIANGLihong,LIXia,etal.*ShijiazhuangMunicipalInstituteforMaternalandChildHealth,Shijiazhuang050051,China

ObjectiveTo observe the effect of Weici combined with electric acupuncture on E2 /P,prolactin(PRL),testosterone(T),ER expression and mammary gland tissue morphous in rats with mammary gland hyperplasia in order to explore its action mechanism.MethodsThe 40 Wistar rats were randomly divided into 4 groups: normal control group,model group,acupuncture group and tamoxifen (TAM) group.The animal models with breast hyperplasia were established by intramuscular injection with diethylstilbestrol+progesteroner.The rats in acupuncture group were fixed and acupunctured (Weici) in the second pair of breasts，and connected with the electric acupuncture instrument for 30 min,moreover, Danzhong acupuncture point was acupunctured for 30min;the rats in TAM group were given tamoxifen 1.8mg/kg by gavage,once a day for 30 days,after last treatment,the serum levels of E2,P,PRL,T were detected,and the ratio of E2/P was calculated,the second pair of breasts were taken to be HE stained,then the changes of breast tissue morphous were observed under light microscope,and the expression levels of ER in breast tissue were detected by immunohistochemisty.ResultsAfter treatment,the ratio of E2/P in acupuncture group and TAM group was significantly lower than that in model group (P<0.05);the serum levels of PRL in acupuncture group and TAM group were obviously lower than those in model group (P<0.05),moreover,there were significant differences between acupuncture group and TAM group (P<0.05).The serum levels of T in acupuncture group and TAM group were significantly lower than those in model group (P<0.05).The pathological changes of breast tissue in acupuncture group were similar to those in TAM group,however,which were obviously improved,as compared with those in model group.The expression levels of ER of breast tissue in TAM group were significantly decreased,furthermore,the AOD value was obviously lower than that of normal control group (P<0.05).ConclusionWeici combined with electric acupuncture can decrease nipple height and nipple diameter,improve disorder state of E2/P,PRL,T and pathological morphous of breast tissue,and reduce ER expression levels in breast tissue of rats with breast hyperplasia.

Weici combined with electric acupuncture;fibrocystic disease of breast;E2 /P;prolactin;testosterone;breast tissue morphous;ER expression;rats

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.07.001

項(xiàng)目來源：河北省中醫(yī)藥管理局科學(xué)技術(shù)研究計(jì)劃課題基金資助項(xiàng)目(編號:2008005)

050051 河北省石家莊市婦幼保健院(荊榮霞)；河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院(梁立紅)；冀中能源峰峰集團(tuán)有限公司邯鄲醫(yī)院(李霞)；河北省中醫(yī)學(xué)院(肖紅玲、張拴成、佘延芬)

R 655.82

A

1002-7386(2014)07-0965-04

2013-10-16)