淺談發(fā)酵工藝中溶氧濃度光學檢測的技術(shù)應用

宋有星 辛 亮

（山東鴻基換熱技術(shù)有限公司，山東濟南250022）

0 引言

溶解氧（DissolvedOxygen，簡稱DO）是指溶解在水或發(fā)酵液中的氧，溶解氧以分子狀態(tài)存在于水或發(fā)酵液中。

水中溶解氧的含量受到2種作用的影響：一種是使DO下降的耗氧作用，包括耗氧有機物降解的耗氧和生物呼吸耗氧；另一種是使DO增加的復氧作用，主要有空氣中氧的溶解、水生植物的光合作用等。這2種作用的相互消長，使水中溶解氧的含量呈現(xiàn)出時空變化。

微生物發(fā)酵是指利用微生物在適宜的條件下，將原料經(jīng)過特定的代謝途徑轉(zhuǎn)化為人類所需要的產(chǎn)物的過程。微生物發(fā)酵生產(chǎn)水平主要取決于菌種本身的遺傳特性和培養(yǎng)條件。

微生物細胞在發(fā)酵過程中要進行上百個酶反應，并受到多種工藝參數(shù)的影響，因此發(fā)酵過程非常復雜，其若要實現(xiàn)藥品質(zhì)量的過程控制較化學合成方式要復雜得多。但隨著對菌體的培養(yǎng)規(guī)律、菌體對環(huán)境條件的要求和代謝變化規(guī)律的創(chuàng)新研究，以及過程檢測技術(shù)的長足進步，通過適時檢測控制發(fā)酵條件和微生物細胞代謝變化有關(guān)的各項工藝參數(shù)，可檢測與控制整個發(fā)酵過程，使菌種的代謝變化按照所需要的條件進展，以達到預期目的。

微生物發(fā)酵中各工藝參數(shù)的過程檢測與控制對于微生物的生長和產(chǎn)物形成有著重要的影響，需要進行過程檢測的有溫度、壓力、空氣流量（需氧發(fā)酵的參數(shù)控制，影響氧或其他參數(shù)的傳遞）、濁度（適時反映細胞生長的狀態(tài)）、pH值（依據(jù)試驗條件獲取的最適宜的pH值作為參照進行適時檢測與調(diào)控）、濃度（適時檢測發(fā)酵液中糖、氮等重要營養(yǎng)物質(zhì)的濃度以及菌體或目標物濃度）、溶氧量（需氧菌發(fā)酵的必備條件和重要參數(shù)）等數(shù)10種工藝參數(shù)。

發(fā)酵液中的溶氧濃度是需氧菌發(fā)酵的必備條件和重要參數(shù)，發(fā)酵液的DO值對菌體生長、目標物的性質(zhì)和產(chǎn)量都會產(chǎn)生不同影響，通過發(fā)酵液中溶氧量的變化，可以了解微生物生長代謝是否正常、工藝控制是否合理、設備供氧能力是否正常等，因此溶氧濃度是生物產(chǎn)品質(zhì)量過程控制的重要參數(shù)之一。

1 溶氧量控制的作用

溶解氧是發(fā)酵過程中至關(guān)重要的一個參數(shù)指標，控制溶解氧的目的是把溶解氧濃度值穩(wěn)定在一定的期望值或范圍內(nèi)。對這些參數(shù)進行精確、實時在線測量是實現(xiàn)溶解氧自動控制的一個基本前提。

發(fā)酵中因受到生物反應器中多種物理、化學和微生物因素的影響和制約，溶解氧濃度與其他工藝參數(shù)的關(guān)系也變得極為復雜。在生物反應器內(nèi)的質(zhì)量傳遞主要為氣-液傳遞和液-固傳遞。氣-液傳遞主要是好氧發(fā)酵過程中的氧傳遞以及二氧化碳的釋放，而液-固傳遞主要發(fā)生于反應系統(tǒng)中含固定化酶、固定化細胞、生物膜、絮凝細胞的過程。

大多數(shù)微生物發(fā)酵過程為好氧的，對于好氧發(fā)酵來說，溶解氧通常既是營養(yǎng)因素，又是環(huán)境因素。特別是對于具有一定氧化還原性質(zhì)的代謝產(chǎn)物的生產(chǎn)來說，DO值的改變勢必會影響到菌株培養(yǎng)體系的氧化還原電位，同時也會對細胞生長和產(chǎn)物的形成產(chǎn)生影響。

發(fā)酵過程中溶氧量會隨著菌體生長的不同階段呈短暫曲線型變化。在發(fā)酵前期，因菌絲大量繁殖，需氧量會大于供氧，溶氧出現(xiàn)短暫低峰；在生長與產(chǎn)物合成階段，需氧量會逐漸減少，溶氧趨于穩(wěn)定，但受補料等條件的影響，又會引起溶氧濃度的下降；在發(fā)酵后期，由于菌體衰老，溶氧濃度又會逐漸上升，一旦菌體自溶，溶氧濃度則會明顯上升。整個發(fā)酵過程是通過在線溶氧濃度檢測和適時改變通氣速率來實現(xiàn)自動化控制的，以便把溶解氧濃度值穩(wěn)定在該菌體生長所需的可控期望值或范圍內(nèi)。

2 溶氧對微生物生長的影響

根據(jù)對氧的需求情況，微生物可分為好氧生物（通氣發(fā)酵）和厭氧生物（靜置發(fā)酵）。

好氧生物的發(fā)酵，只能在有氧的環(huán)境中生存，屬于微生物中的一部分，好氧生物是把氧作為最終的電子受體，借助有氧呼吸獲取生長所需的能量。它包括原核生物中的一部分細菌、放線菌、螺旋體、支原體、立克次氏體、衣原體；真核生物中的一部分真菌、藻類、原生動物；一部分非細胞類的病毒和亞病毒。此類微生物在發(fā)酵過程中為促進生長，一般需要盡可能地提高溶氧度。

厭氧微生物的發(fā)酵有如丙酮丁醇發(fā)酵、酵母菌的酒精發(fā)酵、乳酸發(fā)酵等。其中，產(chǎn)生丙酮、丁醇的梭狀芽孢桿菌（Clostridium）是一種專性厭氧微生物，它的發(fā)酵和菌體發(fā)酵應在無氧條件下進行，氧對其顯示為毒性，會產(chǎn)生甲烷桿菌，此時能否限制DO值在一個較低值就會成為發(fā)酵成敗的關(guān)鍵因素。

還有一種菌種為兼性厭氧微生物，例如酵母菌根據(jù)其生理特點，在種子制備時應在攪拌通風的條件下進行，以促使其生長繁殖，而酒精發(fā)酵則在缺氧條件下進行。乳酸菌大多屬耐氣性厭氧菌，它們的生長和代謝產(chǎn)物合成與氧的有無關(guān)系不大，但為了防止雜菌污染，還是以在缺氧環(huán)境中發(fā)酵為宜。

溶解氧對微生物自身生長的影響很大，DO值的高低會改變微生物的代謝途徑，以致改變發(fā)酵環(huán)境甚至使目標產(chǎn)物發(fā)生偏離。所以，精確檢測溶氧值以便適時調(diào)節(jié)相應的裝置，才能有效完成發(fā)酵過程，降低風險。

3 傳統(tǒng)的溶氧檢測方式

水中溶解氧的含量與大氣壓力、水溫及含鹽量等因素有關(guān)。早在1984年國際標準ISO5814—1984中，即對溶解氧的測定有了標準化規(guī)定，該標準又在1990年國際標準ISO5814—1990中進行過修訂。我國的檢測方法標準GB11913—89《水質(zhì)溶解氧的測定電化學探頭法》的制定時間是1989年，是采用了國際標準ISO5814—1984編制而成。

2009年12月1日我國頒布實施的HJ506—2009《水質(zhì)溶解氧的測定電化學探頭法》中，規(guī)定了測定水中溶解氧的電化學探頭法。該標準是對《水質(zhì)溶解氧的測定電化學探頭法》（GB11913—89）的修訂。自該標準實施之日起，原國家環(huán)境保護局于1989年12月25日批準、發(fā)布的國家環(huán)境保護標準《水質(zhì)溶解氧的測定電化學探頭法》（GB11913—89）廢止。

3.1 電化學探頭法

在HJ506—2009標準中，規(guī)定溶解氧的測定方法為電化學探頭法，在GB11913—89標準中也規(guī)定了電化學探頭法，兩者的原理與測量方法基本一致。

3.1.1 測量原理

溶解氧電化學探頭是一個用選擇性薄膜封閉的小室，室內(nèi)有2個金屬電極并充有電解液，氧和一定數(shù)量的其他氣體及親液物質(zhì)可透過這層薄膜，但水和可溶物質(zhì)的離子幾乎不能透過這層膜。將探頭浸入水中進行溶解氧的測定時，通過電池作用或外加電壓在2個電極間產(chǎn)生電位差，使金屬離子在陽極進入溶液，同時氧氣通過薄膜擴散在陰極獲得電子被還原，產(chǎn)生的電流與穿過薄膜和電解質(zhì)層的氧的傳遞速度成正比，即在一定的溫度下該電流與水中氧的分壓（或濃度）成正比。

薄膜對氣體的滲透性受溫度變化的影響較大，要采用數(shù)學方法對溫度進行校正，也可在電路中安裝熱敏元件對溫度變化進行自動補償。

3.1.2 測量探頭

測量探頭有原電池型（例如鉛/銀）和極譜型（例如銀/金），探頭上宜附有溫度補償裝置。

3.1.3 校準

當測量的溶解液濃度水平低于1mg/L（或10%飽和度），或者當更換溶解氧罩或內(nèi)部的填充電解液時，需要進行零點檢查和調(diào)整。若儀器具有零點補償功能，則不必調(diào)整零點。

3.1.4 測定

將探頭浸入樣品，不能有空氣泡截留在膜上，停留足夠時間，待探頭溫度與水溫達到平衡，且數(shù)字顯示穩(wěn)定時讀數(shù)。必要時根據(jù)所用儀器的型號及對測量結(jié)果的要求，檢測水溫、水壓或含鹽量，并對測量結(jié)果進行校正。探頭的膜接觸樣品時，樣品要保持一定的流速，防止與膜接觸的瞬間將該部位樣品中的溶解氧耗盡，使讀數(shù)發(fā)生波動。

3.1.5 結(jié)果計算

溶解氧的質(zhì)量濃度以每升水中氧的毫克數(shù)表示，也可以用飽和百分率來表示溶解氧的濃度。

3.1.6 電極的維護

注意電極與膜片的清洗，若膜片和電極上有污染物，會引起測量誤差，一般要求1～2周清洗1次。

當電極的線性不合格時，就需要對電極進行再生，電極的再生一般1年1次，包括更換溶解氧膜罩、電解液和清洗電極。每隔一定時間或當膜被損壞和污染時，需要更換溶解氧膜罩并補充新的填充電解液。如果膜未被損壞或污染，建議2個月更換1次填充電解液。

3.2 碘量法

在GB7489—89中規(guī)定了碘量法的溶氧檢測方式，是一種離線取樣檢測的方法。

3.2.1 原理

在水樣中加入硫酸錳和堿性碘化鉀，水中溶解氧將低價錳氧化成高價錳，生成四價錳的氫氧化物棕色沉淀。加酸后，氫氧化物沉淀溶解并與碘離子反應而釋出游離碘。以淀粉作指示劑，用硫代硫酸鈉滴定釋出碘，可計算溶解氧的含量。

3.2.2 測量

3.2.2.1 溶解氧的固定

用吸管插入溶解氧瓶的液面下，加入1mL硫酸錳溶液、2mL堿性碘化鉀溶液，蓋好瓶塞，顛倒混合數(shù)次，靜置。待棕色沉淀物降至瓶內(nèi)一半時，再顛倒混合一次，待沉淀物下降到瓶底。溶解氧一般在取樣現(xiàn)場固定。

3.2.2.2 析出碘

輕輕打開瓶塞，立即用吸管插入液面下，加入2mL硫酸。小心蓋好瓶塞，顛倒混合搖勻，至沉淀物全部溶解為止，放置暗處5min。

3.2.2.3 滴定

吸取100mL上述溶液于250mL錐形瓶中，用硫代硫酸鈉溶液滴定至溶液呈淡黃色，加入1mL淀粉溶液，繼續(xù)滴定至藍色剛好褪去為止，記錄硫代硫酸鈉溶液用量。

計算：

式中 M——硫代硫酸鈉溶液濃度，mol/L；

V——滴定時消耗硫代硫酸鈉溶液體積，mL。

3.2.2.4 精密度和準確度

經(jīng)不同海拔高度的4個實驗室分析于20℃含飽和溶解氧6.85～9.09mg/L的蒸餾水，單個實驗室的相對標準偏差不超過0.3%；含4.73～11.4mg/L溶解氧的地面水，單個實驗室的相對標準偏差不超過0.5%。

溶解氧測量方法除上述幾種最常用的測量方式外，還有“疊氮化鈉修正法”、“高錳酸鉀修正法”等。

4 光學熒光法測量技術(shù)的應用

在過去的50多年里，一直采用電流法和極譜法測量溶解氧。這種方法對于發(fā)酵、市政和工業(yè)廢水中的溶解氧監(jiān)測曾起著非常重要的作用，但是傳統(tǒng)的電化學方法的使用膜、電極和電解液會導致很多問題，即使進行定期維護，還是不能得到準確的測量結(jié)果。

新型熒光技術(shù)不需要使用膜和電解液，幾乎不用維護，性能優(yōu)異，使用方便。本文將淺談光學熒光法的測量的有關(guān)技術(shù)應用。

4.1 原理

熒光法測量溶解氧的技術(shù)是基于熒光淬滅原理，如圖1所示。藍綠光照射到熒光物質(zhì)上激發(fā)熒光物質(zhì)并發(fā)出紅光，由于氧分子可以帶走能量（淬滅效應），所以激發(fā)的紅光的時間和強度與氧分子的濃度成反比。通過測量激發(fā)紅光與參比光的相位差，并與內(nèi)部標定值對比，從而可計算出氧分子的濃度。

圖1 熒光淬滅原理

4.2 國外光學溶氧傳感器的產(chǎn)品研發(fā)與應用

在歐美等國家基于“熒光淬滅”原理已經(jīng)研發(fā)出具體的光學溶氧傳感器或相應的溶氧測量儀，在生物發(fā)酵、水質(zhì)監(jiān)測等領域已經(jīng)被廣泛使用，光學溶氧傳感器的產(chǎn)品設計是通過一個發(fā)光二極管來監(jiān)視傳感器的藍色LED，特定的發(fā)光體被藍光激發(fā)后發(fā)生冷光現(xiàn)象（熒光），帶有紅光過濾器的發(fā)光二極管用來測量冷光產(chǎn)生的紅光，以判斷和計算氧分子的數(shù)量。

4.3 與電化學方式的比較

極譜式溶氧電極在近10年來應用廣泛，但具有一定的局限性，在進行微量測量時不能保證穩(wěn)定和輸出測量數(shù)據(jù)的準確性，當溶氧量保持一定時，因傳感器沒有電流流動而不能動態(tài)地顯示結(jié)果。當線纜發(fā)生故障時，顯示結(jié)果也會保持不變，導致難以發(fā)現(xiàn)故障所在。

光學溶氧傳感器適用于實時溶解氧監(jiān)測，堅固耐用，測量結(jié)果準確，并且易于維護。光學溶解氧傳感器具有很強的耐受性，能承受壓力沖擊、溫度驟變以及能夠?qū)е码娀瘜W電極產(chǎn)生誤報警的斷流效應。光學傳感器無電解液，無需極化，僅需定期更換膜組件即可。更換過程僅需1min，光學溶解氧傳感器的維護便捷。即插即測啟動，所有的傳感器數(shù)據(jù)，包括校準歷史都存儲在傳感器內(nèi)。在執(zhí)行完維護和校準后，在線安裝操作非常簡單。由于具有“即插即測”功能，在將傳感器連接后，所有相關(guān)的數(shù)據(jù)都自動上傳至變送器，并立即顯示氧含量讀數(shù)，且無需極化。傳感器甚至可以預校準并校準曲線，以方便隨時使用，從而更快、更方便地更換傳感器。

表1為光學溶氧與電化學溶氧監(jiān)測技術(shù)的比較與特點。

表1 光學溶氧與電化學溶氧監(jiān)測技術(shù)比較與特點

4.4 以德國Centec光學溶氧傳感器為例簡述其技術(shù)應用

4.4.1 在線溶氧傳感器

表2為在線溶氧傳感器外形及技術(shù)參數(shù)。

4.4.2 便攜式溶氧傳感器

表3為便攜式溶氧傳感器外形及技術(shù)參數(shù)。

4.4.3 應用

過程連接根據(jù)被測設備的接口尺寸選擇，電氣連接輸入一般為24V直流電源，輸出為電流或電壓信號，用于外部顯示或PLC的信號采集。

表2 在線溶氧傳感器外形及技術(shù)參數(shù)

表3 便攜式溶氧傳感器外形及技術(shù)參數(shù)

測量方法是將光學溶氧測量探頭浸入被測液體，通過專用軟件或儀器外部顯示器對各項參數(shù)進行設定，如測量范圍、精度、測量間隔時間、壓力范圍、溫度補償、上限溫度、報警值等項目。氧敏感層的使用壽命與以上參數(shù)的設定有著密切的關(guān)系，如果測量的間隔時間縮短、測量頻率增大就會縮短敏感層的使用壽命。通過設定測量溫度和壓力的上限值，可以在高溫及高壓環(huán)境下停止溶解氧的測量，對光敏感層起到一個保護作用。

5 風險分析

在傳統(tǒng)溶氧類傳感器的產(chǎn)品應用案例中，近年來食品與藥品行業(yè)對傳統(tǒng)電化學式溶氧電極中因為電解液滲漏帶來的潛在風險而受到越來越多的關(guān)注。

電化學溶氧電解的電解液為氫氧化鉀或氯化鉀溶液，具強堿性及腐蝕性。當溶解于水、醇或用酸處理時會產(chǎn)生大量熱量，屬中等毒性，溶于乙醇，微溶于醚，對組織有燒灼作用，可溶解蛋白，形成堿性變性蛋白。溶液或粉塵濺到皮膚上，尤其濺到黏膜，可產(chǎn)生軟痂。溶液濃度越高，溫度越高，作用越強。濺入眼內(nèi)，不僅可損傷角膜，而且能使眼深部組織損傷。

在發(fā)酵過程中出現(xiàn)電解液泄漏的情況會破壞發(fā)酵液的pH值，導致整個批次產(chǎn)品被污染。如果后期沒有及時發(fā)現(xiàn)，成品流通到市場則會對消費者的生命安全帶來極大的威脅。

6 結(jié)語

風險控制并非完全意義上的杜絕風險，而是如何通過先進的技術(shù)創(chuàng)新、產(chǎn)品創(chuàng)新以及質(zhì)量體系文件的建立等多種舉措使得運營風險可控化、可視化，并可實現(xiàn)可追溯。

隨著中國食品藥品質(zhì)量監(jiān)管體系的日趨完善，尤其是在制藥、生物發(fā)酵等特殊行業(yè)中，對于過程的適時檢測與理化分析勢必會成為未來的主流技術(shù)發(fā)展方向。溶氧雖然只是發(fā)酵行業(yè)的諸多工藝參數(shù)之一，但是卻有著至關(guān)重要的作用，所以光學溶氧檢測技術(shù)一定會得到越來越廣泛的應用。

［1］HJ506—2009 水質(zhì) 溶解氧的測定 電化學探頭法［S］

［2］GB7489—89 水質(zhì)溶解氧測定［S］

［3］付燕.微生物來源藥物制備工藝研究中質(zhì)量控制要素探討——發(fā)酵工藝的過程控制［J］.中外健康文摘，2012（8）