高產(chǎn)γ-氨基丁酸菌株的篩選及誘變

黃翠萍+鄭鴻雁

摘要：目的：本實驗利用選擇性培養(yǎng)基BCP從酸菜中篩選一株高產(chǎn)γ-氨基丁酸菌株。方法：對其形態(tài)學(xué)及生理生化實驗進(jìn)行鑒定，利用高效液相色譜法（HPLC）測定發(fā)酵液GABA產(chǎn)量，并對該菌株進(jìn)行紫外及亞硝基胍（NTG）誘變，結(jié)果：確定該菌株為噬酸乳桿菌，編號為SW-135，發(fā)酵液中GABA為0.57克/升，誘變最佳條件為：紫外照射距離20厘米，時間60秒；NTG濃度為0.3克/升，處理時間20分鐘，結(jié)論：誘變后得到高產(chǎn)突變菌株SW-135-13，連續(xù)傳代5次，未見回復(fù)突變，平均GABA產(chǎn)量為1.31克/升。

關(guān)鍵詞：噬酸乳桿菌；γ-氨基丁酸；誘變

中圖分類號：TQ921.3文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號：1674-0432（2014）-05-28-3

0引言

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是天然存在的一種非蛋白質(zhì)組成氨基酸，白色結(jié)晶狀，易潮解，極易溶于水[1]。它具有特殊的生理活性，在動植物體內(nèi)均能發(fā)現(xiàn)它的存在。在豆類、中草藥種子中都含有較多的GABA[2]。在動物體內(nèi)，它主要存在于神經(jīng)組織中，科學(xué)研究表明[3]，它具有較多的生理功能，它能促進(jìn)腦的活化，美容潤膚，改善睡眠，健腦益智，減慢腦衰老機(jī)能，高效減肥，抗驚厥，降低血壓、血氨等功能，同時，還能抑制多種疾病的發(fā)生，比如脂肪肝、腎炎等[4]。

GABA的制備有生物合成法和化學(xué)合成法[5]?；瘜W(xué)合成法要求反應(yīng)條件比較苛刻，成本高，得率低。生物合成法相比較來說既安全、成本又低。目前主要采用曲霉菌、酵母、乳酸菌來發(fā)酵谷氨酸產(chǎn)GABA，由于菌種缺乏安全性，因此找到一株高產(chǎn)可食用的菌種產(chǎn)GABA，勢在必行[6]。

本實驗從酸菜、泡菜、酸奶中篩選出一株產(chǎn)GABA菌株，為了提高其產(chǎn)GABA含量，對其進(jìn)行紫外及亞硝基胍誘變，進(jìn)一步提高其產(chǎn)量，為今后的研究打下了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1材料東北地產(chǎn)自然發(fā)酵的酸菜、泡菜，均購自長春市農(nóng)貿(mào)市場；老北京酸奶，購自長春市佳得樂超市。

1.1.2儀器與設(shè)備CL-32L型全自動高壓滅菌鍋，日本ALP公司；SHP-250型生化培養(yǎng)箱，上海精宏實驗儀器有限公司；XS-402型電子顯微鏡，南京江南光電集團(tuán)股份有限公司；SW-CJ-1FD超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備有限公司。

1.1.3培養(yǎng)基MRS液體培養(yǎng)基（L）：蛋白胨10.0克，牛肉膏10.0克，酵母浸粉5.0克，磷酸二氫鉀2.0克，檸檬酸三銨2.0克，乙酸鈉5.0克，葡萄糖20.0克，吐溫801.0毫升，MgSO4·7H2O 0.5克， MnSO4·4H2O 0.25克，調(diào)pH至6.2～6.4，121℃滅菌20分鐘。

MRS固體培養(yǎng)基：MRS液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加瓊脂15～20克，121℃滅菌20分鐘。用于保藏菌種。

乳酸菌分離培養(yǎng)基（BCP）：酵母粉0.5克，乳糖0.5克，5%溴甲酚紫0.25毫升，水100毫升，pH自然。

BCP固體培養(yǎng)基：在液體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上添加瓊脂20克。

1.1.4試劑γ-氨基丁酸，磷酸吡哆醛，亞硝基胍北京鼎國；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2實驗方法

1.2.1目的菌株的篩選分別取酸菜汁、泡菜汁、酸奶稀釋適當(dāng)?shù)谋稊?shù)，取0.2毫升稀釋液無菌涂布于BCP平板上，35℃靜置培養(yǎng)48小時。

挑選周圍變黃的可疑菌落，采用平板劃線法，反復(fù)純化，直到得到純菌株。

1.2.2γ-氨基丁酸測定方法

1.2.2.1采用薄層層析法定性測定發(fā)酵液中GABA含量[7]

展開劑為正丁醇∶冰醋酸∶水=4∶2∶1，顯色劑為0.6%茚三酮溶液，以5∶2比例加入層析缸內(nèi)，取出（5×10）厘米硅膠板，點(diǎn)取3毫克/毫升GABA標(biāo)準(zhǔn)品和預(yù)處理的發(fā)酵液，完畢后置于80℃烘箱內(nèi)，顯色10分鐘。

1.2.2.2利用高效液相色譜法定量測定發(fā)酵液中GABA含量[8]

取出發(fā)酵液，離心15分鐘（8000轉(zhuǎn)/分鐘），棄沉淀，將上清液濃縮至10毫升，供HPLC分析。以GABA濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3菌種形態(tài)學(xué)及生理生化鑒定觀察平板上菌落形態(tài)，挑取單菌落進(jìn)行革蘭氏染色，在100倍油鏡下觀察單菌株形態(tài)。然后進(jìn)行微生物生理生化實驗，淀粉水解實驗、石蕊牛乳試驗、硫化氫實驗、明膠液化實驗、葡萄糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣實驗。

1.2.4微生物生長曲線將斜面保存菌種，以5%接種量接入100毫升MRS液體培養(yǎng)基中，35℃培養(yǎng)24小時，實驗中每隔2小時取一次菌液，以未接菌培養(yǎng)的培養(yǎng)基做對照，在波長600毫米處測定其吸光值。繪制菌體生長曲線圖。

1.2.5菌株的誘變

1.2.5.1紫外誘變[9]取發(fā)酵菌液20毫升置于空培養(yǎng)皿中，放到距離25W紫外燈20厘米處，再打開磁力攪拌器，分別誘變5秒、15秒、25秒、30秒、35秒、45秒、60秒。取各個誘變菌液1毫升分別稀釋10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，然后分別吸取誘變菌液0.2毫升涂布于BCP平板上，同時，以未誘變菌種作對照。35℃培養(yǎng)48小時，計算誘變菌種的致死率。

1.2.5.2亞硝基胍（NTG）誘變[10]取菌懸液20毫升離心15分鐘（8000r/分鐘），棄上清液，用滅菌的生理鹽水洗滌一次沉淀，再加入20毫升滅菌生理鹽水，震蕩均勻。以10毫克NTG：1毫升丙酮的體積比配制亞硝基胍誘變?nèi)芤?，再?.3克/升亞硝基胍誘變液加入到菌液中，35℃、90轉(zhuǎn)/秒分別處理20分鐘、30分鐘、40分鐘、50分鐘，然后計算致死率，確定處理時間。

在確定處理時間基礎(chǔ)上，在分別將0.1克/升、0.2克/升、0.3克/升、0.4克/升、0.5克/升的亞硝基胍誘變液加入到菌懸液中，處理一定時間，計算致死率，確定處理劑量。

1.2.5.3致死率的計算

計算公式如下：

2.3菌株的生長曲線

菌株的生長曲線圖如圖3，圖3表明，菌株的對數(shù)生長期為2～12小時。

2.4菌株的誘變

2.4.1紫外誘變時間的確定紫外誘變時間與SW-135致死率關(guān)系如圖4。根據(jù)文獻(xiàn)報道[12]，一般把致死率在80%～90%的范圍作為紫外誘變最佳時間，此時容易篩選到高產(chǎn)正突變株。圖4表明，當(dāng)菌液稀釋到10～3時，紫外照射60秒，致死率為85.5%。因此，本實驗選取最佳誘變時間為60秒。

2.4.2亞硝基胍誘變劑量的確定如圖5所示，隨著亞硝基胍處理時間的增加，致死率也不斷的增加，當(dāng)處理時間為30分鐘時，致死率為86.2%，因此，選擇最佳處理時間為30分鐘。但是致死率還與亞硝基胍濃度有關(guān)系，在確定了最佳處理時間的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考查了亞硝基胍濃度與致死率的關(guān)系。如圖6所示，當(dāng)其濃度為0.3克/升時，致死率為87.1%。因此本實驗選擇亞硝基胍濃度為0.3克/升。

2.4.3菌株的遺傳穩(wěn)定性將突變菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng)，用高效液相發(fā)檢測發(fā)酵液中γ-氨基丁酸含量[13]，突變菌株遺傳穩(wěn)定，未見回復(fù)突變，菌株產(chǎn)γ-氨基丁酸高達(dá)1.35克/升，較誘變前菌株提高了0.78克/升。

3討論

本實驗從酸菜、泡菜、酸奶中篩選出5株產(chǎn)菌株，經(jīng)過復(fù)篩得到一株高產(chǎn)的噬酸乳桿菌，命名為SW-135，其產(chǎn)量為0.57克/升，并以SW-135為出發(fā)菌株進(jìn)行紫外和亞硝基胍誘變，研究發(fā)現(xiàn)紫外誘變最佳時間為60秒；亞硝基胍誘變最佳濃度0.3克/升時處理時間30分鐘。經(jīng)過誘變和篩選，得到高產(chǎn)突變菌株SW-135-13，產(chǎn)量為1.35克/升，是出發(fā)菌株2.37倍[14]。

參考文獻(xiàn)

[1]趙玉紅，張立鋼，龐偉娜.乳酸菌和酵母菌共生發(fā)酵面包的研究[J].食品工業(yè)技術(shù)，2003，24 （3）：61-62.

[2]吳祖興.乳酸菌在發(fā)酵香腸中的應(yīng)用研究[J].食品工業(yè)科技，2002，23（8）：55-57.

[3]李志成，嚴(yán)佩峰，李紅蕊，等.乳酸菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基比較研究[J].食品研究與開發(fā)，2007，23 （11）：68-75.

[4]劉屹峰.乳酸菌的生理特性和生物學(xué)功能[J].丹東紡專學(xué)報，2002，16 （2）：36-44.

[5]談重芳，王雁萍，霍裕平，等.乳酸菌鑒定方法在食品工業(yè)中的應(yīng)用及研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2007，（2）：76-85.

[6]趙斌，何紹江.微生物實驗[M].北京：科學(xué)出版社，2004.

[7]徐成勇，郭本恒，吳昊.酸奶發(fā)酵劑和乳酸菌生物技術(shù)育種[J] .中國生物工程雜志，2004，（7）：55-59.

[8]欒金水.乳酸菌的研究應(yīng)用進(jìn)展[J].江蘇調(diào)味副食品， 2004，21（1）：8-10.

[9]黃君紅，成潔珊，陳青荷.乳酸菌生長最佳培養(yǎng)基的篩選[J].中國釀造，2001，（2）：9-11.

[10]徐冬云，周立平，童振宇，等.產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌的分離篩選[J].現(xiàn)代食品科技，2006，22（3）：59-64.

[11] Guin TWC，Bottiglieri TSI.GABA，γ-hydroxybutyric acid， and neurological disease [J].Ann Neurol，2003，6：3-12.

[12] Xiao -feng Guo， Hitoshi. Identification of highγ-Aminobutyric Acid producing Marine Yeast Strains by Physiological and Biochemical Characteristics and Gene sequence Analyses [J]. Biosci. Biotechonol. Biochem.，2009，73（7），1527-1534.

[13]李玉萍，熊向源，葉軍等.γ-氨基丁酸在開發(fā)功能性食品中的應(yīng)用[J].河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，12（11）：52-54，69.

[14]葉硯，蔣冬花，嵇豪.響應(yīng)面法優(yōu)化紅曲X27液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)γ-氨基丁酸工藝條件[J].中國糧油學(xué)報，2010，25（9）.

作者簡介：黃翠萍，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，碩士研究生，研究方向：微生物菌種篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化。

通訊作者：鄭鴻雁，碩士，副教授，研究方向：功能食品、微生物菌種篩選及發(fā)酵工藝研究。

1.2.5.3致死率的計算

計算公式如下：

2.3菌株的生長曲線

菌株的生長曲線圖如圖3，圖3表明，菌株的對數(shù)生長期為2～12小時。

2.4菌株的誘變

2.4.1紫外誘變時間的確定紫外誘變時間與SW-135致死率關(guān)系如圖4。根據(jù)文獻(xiàn)報道[12]，一般把致死率在80%～90%的范圍作為紫外誘變最佳時間，此時容易篩選到高產(chǎn)正突變株。圖4表明，當(dāng)菌液稀釋到10～3時，紫外照射60秒，致死率為85.5%。因此，本實驗選取最佳誘變時間為60秒。

2.4.2亞硝基胍誘變劑量的確定如圖5所示，隨著亞硝基胍處理時間的增加，致死率也不斷的增加，當(dāng)處理時間為30分鐘時，致死率為86.2%，因此，選擇最佳處理時間為30分鐘。但是致死率還與亞硝基胍濃度有關(guān)系，在確定了最佳處理時間的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考查了亞硝基胍濃度與致死率的關(guān)系。如圖6所示，當(dāng)其濃度為0.3克/升時，致死率為87.1%。因此本實驗選擇亞硝基胍濃度為0.3克/升。

2.4.3菌株的遺傳穩(wěn)定性將突變菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng)，用高效液相發(fā)檢測發(fā)酵液中γ-氨基丁酸含量[13]，突變菌株遺傳穩(wěn)定，未見回復(fù)突變，菌株產(chǎn)γ-氨基丁酸高達(dá)1.35克/升，較誘變前菌株提高了0.78克/升。

3討論

本實驗從酸菜、泡菜、酸奶中篩選出5株產(chǎn)菌株，經(jīng)過復(fù)篩得到一株高產(chǎn)的噬酸乳桿菌，命名為SW-135，其產(chǎn)量為0.57克/升，并以SW-135為出發(fā)菌株進(jìn)行紫外和亞硝基胍誘變，研究發(fā)現(xiàn)紫外誘變最佳時間為60秒；亞硝基胍誘變最佳濃度0.3克/升時處理時間30分鐘。經(jīng)過誘變和篩選，得到高產(chǎn)突變菌株SW-135-13，產(chǎn)量為1.35克/升，是出發(fā)菌株2.37倍[14]。

參考文獻(xiàn)

[1]趙玉紅，張立鋼，龐偉娜.乳酸菌和酵母菌共生發(fā)酵面包的研究[J].食品工業(yè)技術(shù)，2003，24 （3）：61-62.

[2]吳祖興.乳酸菌在發(fā)酵香腸中的應(yīng)用研究[J].食品工業(yè)科技，2002，23（8）：55-57.

[3]李志成，嚴(yán)佩峰，李紅蕊，等.乳酸菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基比較研究[J].食品研究與開發(fā)，2007，23 （11）：68-75.

[4]劉屹峰.乳酸菌的生理特性和生物學(xué)功能[J].丹東紡專學(xué)報，2002，16 （2）：36-44.

[5]談重芳，王雁萍，霍裕平，等.乳酸菌鑒定方法在食品工業(yè)中的應(yīng)用及研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2007，（2）：76-85.

[6]趙斌，何紹江.微生物實驗[M].北京：科學(xué)出版社，2004.

[7]徐成勇，郭本恒，吳昊.酸奶發(fā)酵劑和乳酸菌生物技術(shù)育種[J] .中國生物工程雜志，2004，（7）：55-59.

[8]欒金水.乳酸菌的研究應(yīng)用進(jìn)展[J].江蘇調(diào)味副食品， 2004，21（1）：8-10.

[9]黃君紅，成潔珊，陳青荷.乳酸菌生長最佳培養(yǎng)基的篩選[J].中國釀造，2001，（2）：9-11.

[10]徐冬云，周立平，童振宇，等.產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌的分離篩選[J].現(xiàn)代食品科技，2006，22（3）：59-64.

[11] Guin TWC，Bottiglieri TSI.GABA，γ-hydroxybutyric acid， and neurological disease [J].Ann Neurol，2003，6：3-12.

[12] Xiao -feng Guo， Hitoshi. Identification of highγ-Aminobutyric Acid producing Marine Yeast Strains by Physiological and Biochemical Characteristics and Gene sequence Analyses [J]. Biosci. Biotechonol. Biochem.，2009，73（7），1527-1534.

[13]李玉萍，熊向源，葉軍等.γ-氨基丁酸在開發(fā)功能性食品中的應(yīng)用[J].河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，12（11）：52-54，69.

[14]葉硯，蔣冬花，嵇豪.響應(yīng)面法優(yōu)化紅曲X27液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)γ-氨基丁酸工藝條件[J].中國糧油學(xué)報，2010，25（9）.

作者簡介：黃翠萍，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，碩士研究生，研究方向：微生物菌種篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化。

通訊作者：鄭鴻雁，碩士，副教授，研究方向：功能食品、微生物菌種篩選及發(fā)酵工藝研究。

1.2.5.3致死率的計算

計算公式如下：

2.3菌株的生長曲線

菌株的生長曲線圖如圖3，圖3表明，菌株的對數(shù)生長期為2～12小時。

2.4菌株的誘變

2.4.1紫外誘變時間的確定紫外誘變時間與SW-135致死率關(guān)系如圖4。根據(jù)文獻(xiàn)報道[12]，一般把致死率在80%～90%的范圍作為紫外誘變最佳時間，此時容易篩選到高產(chǎn)正突變株。圖4表明，當(dāng)菌液稀釋到10～3時，紫外照射60秒，致死率為85.5%。因此，本實驗選取最佳誘變時間為60秒。

2.4.2亞硝基胍誘變劑量的確定如圖5所示，隨著亞硝基胍處理時間的增加，致死率也不斷的增加，當(dāng)處理時間為30分鐘時，致死率為86.2%，因此，選擇最佳處理時間為30分鐘。但是致死率還與亞硝基胍濃度有關(guān)系，在確定了最佳處理時間的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考查了亞硝基胍濃度與致死率的關(guān)系。如圖6所示，當(dāng)其濃度為0.3克/升時，致死率為87.1%。因此本實驗選擇亞硝基胍濃度為0.3克/升。

2.4.3菌株的遺傳穩(wěn)定性將突變菌株進(jìn)行傳代培養(yǎng)，用高效液相發(fā)檢測發(fā)酵液中γ-氨基丁酸含量[13]，突變菌株遺傳穩(wěn)定，未見回復(fù)突變，菌株產(chǎn)γ-氨基丁酸高達(dá)1.35克/升，較誘變前菌株提高了0.78克/升。

3討論

本實驗從酸菜、泡菜、酸奶中篩選出5株產(chǎn)菌株，經(jīng)過復(fù)篩得到一株高產(chǎn)的噬酸乳桿菌，命名為SW-135，其產(chǎn)量為0.57克/升，并以SW-135為出發(fā)菌株進(jìn)行紫外和亞硝基胍誘變，研究發(fā)現(xiàn)紫外誘變最佳時間為60秒；亞硝基胍誘變最佳濃度0.3克/升時處理時間30分鐘。經(jīng)過誘變和篩選，得到高產(chǎn)突變菌株SW-135-13，產(chǎn)量為1.35克/升，是出發(fā)菌株2.37倍[14]。

參考文獻(xiàn)

[1]趙玉紅，張立鋼，龐偉娜.乳酸菌和酵母菌共生發(fā)酵面包的研究[J].食品工業(yè)技術(shù)，2003，24 （3）：61-62.

[2]吳祖興.乳酸菌在發(fā)酵香腸中的應(yīng)用研究[J].食品工業(yè)科技，2002，23（8）：55-57.

[3]李志成，嚴(yán)佩峰，李紅蕊，等.乳酸菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基比較研究[J].食品研究與開發(fā)，2007，23 （11）：68-75.

[4]劉屹峰.乳酸菌的生理特性和生物學(xué)功能[J].丹東紡專學(xué)報，2002，16 （2）：36-44.

[5]談重芳，王雁萍，霍裕平，等.乳酸菌鑒定方法在食品工業(yè)中的應(yīng)用及研究進(jìn)展[J].食品工業(yè)科技，2007，（2）：76-85.

[6]趙斌，何紹江.微生物實驗[M].北京：科學(xué)出版社，2004.

[7]徐成勇，郭本恒，吳昊.酸奶發(fā)酵劑和乳酸菌生物技術(shù)育種[J] .中國生物工程雜志，2004，（7）：55-59.

[8]欒金水.乳酸菌的研究應(yīng)用進(jìn)展[J].江蘇調(diào)味副食品， 2004，21（1）：8-10.

[9]黃君紅，成潔珊，陳青荷.乳酸菌生長最佳培養(yǎng)基的篩選[J].中國釀造，2001，（2）：9-11.

[10]徐冬云，周立平，童振宇，等.產(chǎn)γ-氨基丁酸乳酸菌的分離篩選[J].現(xiàn)代食品科技，2006，22（3）：59-64.

[11] Guin TWC，Bottiglieri TSI.GABA，γ-hydroxybutyric acid， and neurological disease [J].Ann Neurol，2003，6：3-12.

[12] Xiao -feng Guo， Hitoshi. Identification of highγ-Aminobutyric Acid producing Marine Yeast Strains by Physiological and Biochemical Characteristics and Gene sequence Analyses [J]. Biosci. Biotechonol. Biochem.，2009，73（7），1527-1534.

[13]李玉萍，熊向源，葉軍等.γ-氨基丁酸在開發(fā)功能性食品中的應(yīng)用[J].河北農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008，12（11）：52-54，69.

[14]葉硯，蔣冬花，嵇豪.響應(yīng)面法優(yōu)化紅曲X27液態(tài)發(fā)酵產(chǎn)γ-氨基丁酸工藝條件[J].中國糧油學(xué)報，2010，25（9）.

作者簡介：黃翠萍，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，碩士研究生，研究方向：微生物菌種篩選及發(fā)酵條件優(yōu)化。

通訊作者：鄭鴻雁，碩士，副教授，研究方向：功能食品、微生物菌種篩選及發(fā)酵工藝研究。