超聲波輔助提取米糠甾醇的工藝優(yōu)化

王紅利　張立

摘 要：為了尋求最佳的超聲波輔助提取米糠甾醇工藝條件，試驗采用二水平Plackett-Burman設(shè)計對影響米糠甾醇提取的各因素進行篩選，獲得影響最大的五個因素：超聲波時間，超聲波溫度、超聲波功率、料液比和顆粒度。采用正交試驗設(shè)計優(yōu)化了米糠甾醇的超聲波輔助提取工藝。試驗結(jié)果表明最佳提取工藝參數(shù)為：超聲波時間70min，超聲波溫度60℃，料液比1：25g/mL，超聲波功率150W，顆粒度60目，此條件下的提取率達(dá)4.1497mg/g。

關(guān)鍵詞：米糠；甾醇；超聲波；輔助提取

前言

米糠作為一種可再生的寶貴資源，在過去一段時間里沒能得到全面高效的利用，直至研究發(fā)現(xiàn)米糠中含有米糠油、植酸、谷維素、甾醇等多種活性成分才受到重視。米糠作為傳統(tǒng)的飼料基料已有很長的應(yīng)用歷史，其活性成分甾醇能明顯降低血液中總膽固醇和低密度脂蛋白膽固醇的含量，同時還具有免疫抵抗、調(diào)節(jié)動物生長、類激素、抗氧化等功能，是不可多得的綠色功能性飼料添加劑。本文探討了米糠甾醇的超聲波提取條件，旨在為米糠甾醇的深入研究及在飼料中的應(yīng)用提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料及儀器

米糠（漢中本地），甾醇標(biāo)準(zhǔn)品（陜西天維生物制品有限公司，純度95%），乙酸乙酯、無水乙醇、乙酸酐、濃硫酸、石油醚均為分析純。

WF-2000超聲波快速反應(yīng)系統(tǒng)（上海屹堯分析儀器有限公司）；Cary50型紫外可見分光光度計 （美國瓦里安）；FW117中草藥粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司）；SHZ-D9（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限公司）；GR-200電子天平（日本AND）等。

1.2 方法

1.2.1 甾醇標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取1.0000g甾醇標(biāo)準(zhǔn)品，用乙酸酐在燒杯中溶解，移入100mL的容量瓶中定容，精密量取1mL上述溶液移入100mL容量瓶中再定容，分別精密量取0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0mL分別移入9個10mL試管中，加入0.1mL的濃硫酸，根據(jù)Lie-Bur比色法，待試管中的顏色由紅色變?yōu)榘稻G色，穩(wěn)定15min后，測得最大吸收波長為650.00nm，用1cm比色皿于650.00nm處測定不同濃度甾醇標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：y=5.6821X-0.0351，相關(guān)系數(shù)R2=0.9928，說明在測定范圍內(nèi)甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液的線性關(guān)系良好。

式中：y-吸光度值， x-甾醇標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度，mg/mL。

1.2.2 米糠甾醇提取流程

米糠→干燥粉碎→過60目篩→加入乙酸乙酯→超聲波反應(yīng)→抽濾→離心→取上清液→按照1.2.1 步驟測定吸光度→計算提取率

1.2.3 米糠甾醇含量的測定

用移液管精密量取1.0mL提取液離心后的上清液，按照1.2.1的操作方法測定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程中計算提取液中甾醇濃度C，按下式計算甾醇提取率：

C-測定液甾醇濃度；V-測定液總體積；Q-測定液稀釋總倍數(shù)；

W-一次提取所用米糠粉末質(zhì)量；V0-比色皿中測定溶液體積；

1.3 超聲波提取米糠甾醇的優(yōu)化設(shè)計

1.3.1 Plackett-Burman設(shè)計

選擇超聲波溫度、料液比、超聲波時間、超聲波功率、顆粒度、提取次數(shù)六個因素進行全面考察，選用N=12的Plackett-Burman設(shè)計，考察各因素的主效應(yīng)，確定其對米糠甾醇提取率的影響順序。

1.3.2 正交試驗優(yōu)化設(shè)計

以Plackett-Burman篩選出的五個主要因素作為影響因素，以米糠甾醇提取率為指標(biāo)，采用L16（45）正交試驗設(shè)計對提取工藝進行優(yōu)化。

2 試驗結(jié)果

2.1 不同提取劑對米糠甾醇提取率的影響

分別稱取1.000g 60目的干燥米糠粉末3份，設(shè)定超聲波功率150W，超聲波溫度50℃，超聲波時間60min，料液比1∶20（g/mL），分別以乙醇、乙酸乙酯、丙酮、石油醚作為提取劑提取一次，研究不同提取劑對米糠甾醇提取率的影響，結(jié)果如表1所示。

由表1可知，各提取劑提取米糠甾醇提取率的大小順序為：乙酸乙酯>石油醚>乙醇，因此選擇乙酸乙酯作為所用提取劑。

2.2 單因素試驗結(jié)果及分析

2.2.1 顆粒度對米糠甾醇提取率的影響

稱取顆粒度分別為20目、40目、60目、80目、100目的備用米糠粉末各1.0000g，設(shè)定超聲波功率150W，超聲波溫度50℃，超聲波時間60min，料液比1：20（g/mL），提取一次，考察不同顆粒度對米糠甾醇提取率的影響，結(jié)果如圖1所示。

原料的顆粒度越細(xì)，提取率越高，但同時容易出現(xiàn)粘合結(jié)塊現(xiàn)象，米糠中含有少量的多糖，多糖的溶出可能會堵塞甾醇的溶出通道，提取效果并不理想。由圖1可知，60目時提取率最高，大于60目，甾醇提取率因多糖的溶出而降低，所以選擇顆粒度為60目為宜。

2.2.2 超聲波時間對米糠甾醇提取率的影響

分別稱取1.0000g顆粒度為60目的備用米糠粉末5份，設(shè)定超聲波功率150W，超聲波溫度50℃，料液比1：20（g/mL），提取一次，考察不同超聲波時間對米糠甾醇提取率的影響，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，隨著超聲波反應(yīng)時間的延長米糠甾醇的提取率不斷增大，反應(yīng)70min時提取率最大，超過70min后提取率明顯減小，這可能是因為長時間的超聲波反應(yīng)對甾醇的結(jié)構(gòu)有一定程度的破壞，故選擇超聲波時間為70min為宜。

2.2.3 超聲波溫度對米糠甾醇提取率的影響

分別稱取1.0000g顆粒度為60目的備用米糠粉末5份，設(shè)定超聲波功率150W，超聲波時間60min，料液比1：20（g/mL），提取一次，考察不同超聲波溫度對米糠甾醇提取率的影響，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，隨著超聲波溫度的提高，米糠甾醇的提取率也相應(yīng)增大，超聲波溫度為60℃時提取率最大，已達(dá)到甾醇分子熱運動的極點，繼續(xù)升溫，甾醇分子結(jié)構(gòu)遭到破壞，提取率降低。因此，選擇60℃為較佳超聲波提取溫度。

2.2.4 超聲波功率對米糠甾醇提取率的影響

分別稱取1.0000g顆粒度為60目的備用米糠粉末5份，設(shè)定超聲波溫度50℃，超聲波時間60min，料液比1：20（g/mL），提取一次，考察不同超聲波功率對米糠甾醇提取率的影響，結(jié)果如圖4所示。

超聲波功率越大，空化作用愈強烈，但超聲功率增大到一定程度時容易產(chǎn)生大量無用的空化泡，增加散射衰減，形成聲屏障，反而會減弱提取效果。由圖4可知，超聲功率為150W時甾醇提取率最大；繼續(xù)增大超聲波功率，米糠甾醇提取率減小，故選擇150W為較佳超聲波功率。

2.2.5 料液比對米糠甾醇提取率的影響

分別稱取1.0000g顆粒度為60目的備用米糠粉末5份，設(shè)定超聲波溫度50℃，超聲波時間60min，超聲波功率150W，提取一次，考察不同料液比對米糠甾醇提取率的影響，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知米糠甾醇提取率在1：10g/mL～1：25g/mL范圍內(nèi)隨著料液比的增大而增大，之后提取率減小，料液比為1：25g/mL時提取率最大，增大料液比，分子間的傳質(zhì)及傳熱作用增強，提取率相應(yīng)增大，綜合考慮提取成本及后期純化工序，選擇1：25g/mL作為較佳料液比。

2.2.6 提取次數(shù)對米糠甾醇提取率的影響

稱取1份顆粒度為60目的備用米糠粉末1.0000g，設(shè)定超聲波溫度50℃，超聲波時間60min，超聲波功率150W進行超聲波提取，將第一次提取后的濾渣干燥至恒重作為第二次提取的原料，將第二次提取后的濾渣再作為第三次提取的原料，考察不同提取次數(shù)對米糠甾醇提取率的影響，結(jié)果如表2所示，由表2可知，一次提取已經(jīng)基本上將米糠中的甾醇全部提取，多次提取成本增加，故試驗均提取一次。

2.3 Plackett-Burman設(shè)計篩選米糠甾醇提取率重要影響因子

按照1.3.1的試驗步驟，對超聲波時間（A）、料液比（C）、超聲波功率（D）、顆粒度（E）、超聲波溫度（G）、提取次數(shù)（H）六個因素外加兩個虛擬列B列和F列進行考察，每個因素取低水平“-1”和高水平“1”，響應(yīng)值為米糠甾醇提取率Y。試驗設(shè)計安排與結(jié)果見表3，因素效應(yīng)見表4。

Pr值小于0.05表明此因素對試驗結(jié)果影響顯著，Pr值小于0.01表明此因素對試驗結(jié)果影響極顯著。利用SAS8.1軟件的二水平設(shè)計分析因素的主效應(yīng)，根據(jù)表4的結(jié)果，選擇超聲波時間、超聲波溫度、料液比、超聲波功率及顆粒度為正交優(yōu)化試驗的五個主要影響因素。

2.4 正交試驗結(jié)果及分析

在單因素試驗及Plackett-Burman設(shè)計篩選的基礎(chǔ)上選擇選擇超聲波時間、超聲波溫度、料液比、超聲波功率及顆粒度為正交優(yōu)化試驗的五個主要影響因素，以提取率為指標(biāo)，選擇L16（45）設(shè)計表進行，正交結(jié)果見表5。

由表5可知影響米糠甾醇提取率的因素大小順序為：料液比>超聲波功率>超聲波時間>超聲波溫度>顆粒度，與Plackett-Burman設(shè)計篩選的結(jié)果一致。最佳提取工藝為：超聲波時間70min，超聲波溫度60℃，料液比1：25g/mL，超聲波功率150W，顆粒度60目，為了驗證此條件是否為最佳工藝組合，進行三次平行提取試驗，三次試驗的提取率分別為4.1893mg/g、4.1035mg/g、4.1563mg/g，取其平均值4.1497mg/g為此條件下的提取率。此條件下的提取率高于正交中的任何組合，因此確定其為最佳工藝。

3 結(jié)論

Plackett-Burman設(shè)計試驗?zāi)茉谳^多影響因子中篩選出對實驗影響顯著的因素，有效減少試驗次數(shù)及強度。通過正交優(yōu)化得出超聲波輔助提取米糠甾醇的最佳提取工藝條件：超聲波時間70min，超聲波溫度60℃，料液比1：25g/mL，超聲波功率150W，顆粒度60目，此條件下的提取率為4.1497mg/g。影響米糠甾醇提取率的因素大小順序為：料液比>超聲波功率>超聲波時間>超聲波溫度>顆粒度。參考文獻（略）

由圖3可知，隨著超聲波溫度的提高，米糠甾醇的提取率也相應(yīng)增大，超聲波溫度為60℃時提取率最大，已達(dá)到甾醇分子熱運動的極點，繼續(xù)升溫，甾醇分子結(jié)構(gòu)遭到破壞，提取率降低。因此，選擇60℃為較佳超聲波提取溫度。

2.2.4 超聲波功率對米糠甾醇提取率的影響

分別稱取1.0000g顆粒度為60目的備用米糠粉末5份，設(shè)定超聲波溫度50℃，超聲波時間60min，料液比1：20（g/mL），提取一次，考察不同超聲波功率對米糠甾醇提取率的影響，結(jié)果如圖4所示。

超聲波功率越大，空化作用愈強烈，但超聲功率增大到一定程度時容易產(chǎn)生大量無用的空化泡，增加散射衰減，形成聲屏障，反而會減弱提取效果。由圖4可知，超聲功率為150W時甾醇提取率最大；繼續(xù)增大超聲波功率，米糠甾醇提取率減小，故選擇150W為較佳超聲波功率。

2.2.5 料液比對米糠甾醇提取率的影響

分別稱取1.0000g顆粒度為60目的備用米糠粉末5份，設(shè)定超聲波溫度50℃，超聲波時間60min，超聲波功率150W，提取一次，考察不同料液比對米糠甾醇提取率的影響，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知米糠甾醇提取率在1：10g/mL～1：25g/mL范圍內(nèi)隨著料液比的增大而增大，之后提取率減小，料液比為1：25g/mL時提取率最大，增大料液比，分子間的傳質(zhì)及傳熱作用增強，提取率相應(yīng)增大，綜合考慮提取成本及后期純化工序，選擇1：25g/mL作為較佳料液比。

2.2.6 提取次數(shù)對米糠甾醇提取率的影響

稱取1份顆粒度為60目的備用米糠粉末1.0000g，設(shè)定超聲波溫度50℃，超聲波時間60min，超聲波功率150W進行超聲波提取，將第一次提取后的濾渣干燥至恒重作為第二次提取的原料，將第二次提取后的濾渣再作為第三次提取的原料，考察不同提取次數(shù)對米糠甾醇提取率的影響，結(jié)果如表2所示，由表2可知，一次提取已經(jīng)基本上將米糠中的甾醇全部提取，多次提取成本增加，故試驗均提取一次。

2.3 Plackett-Burman設(shè)計篩選米糠甾醇提取率重要影響因子

按照1.3.1的試驗步驟，對超聲波時間（A）、料液比（C）、超聲波功率（D）、顆粒度（E）、超聲波溫度（G）、提取次數(shù)（H）六個因素外加兩個虛擬列B列和F列進行考察，每個因素取低水平“-1”和高水平“1”，響應(yīng)值為米糠甾醇提取率Y。試驗設(shè)計安排與結(jié)果見表3，因素效應(yīng)見表4。

Pr值小于0.05表明此因素對試驗結(jié)果影響顯著，Pr值小于0.01表明此因素對試驗結(jié)果影響極顯著。利用SAS8.1軟件的二水平設(shè)計分析因素的主效應(yīng)，根據(jù)表4的結(jié)果，選擇超聲波時間、超聲波溫度、料液比、超聲波功率及顆粒度為正交優(yōu)化試驗的五個主要影響因素。

2.4 正交試驗結(jié)果及分析

在單因素試驗及Plackett-Burman設(shè)計篩選的基礎(chǔ)上選擇選擇超聲波時間、超聲波溫度、料液比、超聲波功率及顆粒度為正交優(yōu)化試驗的五個主要影響因素，以提取率為指標(biāo)，選擇L16（45）設(shè)計表進行，正交結(jié)果見表5。

由表5可知影響米糠甾醇提取率的因素大小順序為：料液比>超聲波功率>超聲波時間>超聲波溫度>顆粒度，與Plackett-Burman設(shè)計篩選的結(jié)果一致。最佳提取工藝為：超聲波時間70min，超聲波溫度60℃，料液比1：25g/mL，超聲波功率150W，顆粒度60目，為了驗證此條件是否為最佳工藝組合，進行三次平行提取試驗，三次試驗的提取率分別為4.1893mg/g、4.1035mg/g、4.1563mg/g，取其平均值4.1497mg/g為此條件下的提取率。此條件下的提取率高于正交中的任何組合，因此確定其為最佳工藝。

3 結(jié)論

Plackett-Burman設(shè)計試驗?zāi)茉谳^多影響因子中篩選出對實驗影響顯著的因素，有效減少試驗次數(shù)及強度。通過正交優(yōu)化得出超聲波輔助提取米糠甾醇的最佳提取工藝條件：超聲波時間70min，超聲波溫度60℃，料液比1：25g/mL，超聲波功率150W，顆粒度60目，此條件下的提取率為4.1497mg/g。影響米糠甾醇提取率的因素大小順序為：料液比>超聲波功率>超聲波時間>超聲波溫度>顆粒度。參考文獻（略）

由圖3可知，隨著超聲波溫度的提高，米糠甾醇的提取率也相應(yīng)增大，超聲波溫度為60℃時提取率最大，已達(dá)到甾醇分子熱運動的極點，繼續(xù)升溫，甾醇分子結(jié)構(gòu)遭到破壞，提取率降低。因此，選擇60℃為較佳超聲波提取溫度。

2.2.4 超聲波功率對米糠甾醇提取率的影響

分別稱取1.0000g顆粒度為60目的備用米糠粉末5份，設(shè)定超聲波溫度50℃，超聲波時間60min，料液比1：20（g/mL），提取一次，考察不同超聲波功率對米糠甾醇提取率的影響，結(jié)果如圖4所示。

超聲波功率越大，空化作用愈強烈，但超聲功率增大到一定程度時容易產(chǎn)生大量無用的空化泡，增加散射衰減，形成聲屏障，反而會減弱提取效果。由圖4可知，超聲功率為150W時甾醇提取率最大；繼續(xù)增大超聲波功率，米糠甾醇提取率減小，故選擇150W為較佳超聲波功率。

2.2.5 料液比對米糠甾醇提取率的影響

分別稱取1.0000g顆粒度為60目的備用米糠粉末5份，設(shè)定超聲波溫度50℃，超聲波時間60min，超聲波功率150W，提取一次，考察不同料液比對米糠甾醇提取率的影響，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知米糠甾醇提取率在1：10g/mL～1：25g/mL范圍內(nèi)隨著料液比的增大而增大，之后提取率減小，料液比為1：25g/mL時提取率最大，增大料液比，分子間的傳質(zhì)及傳熱作用增強，提取率相應(yīng)增大，綜合考慮提取成本及后期純化工序，選擇1：25g/mL作為較佳料液比。

2.2.6 提取次數(shù)對米糠甾醇提取率的影響

稱取1份顆粒度為60目的備用米糠粉末1.0000g，設(shè)定超聲波溫度50℃，超聲波時間60min，超聲波功率150W進行超聲波提取，將第一次提取后的濾渣干燥至恒重作為第二次提取的原料，將第二次提取后的濾渣再作為第三次提取的原料，考察不同提取次數(shù)對米糠甾醇提取率的影響，結(jié)果如表2所示，由表2可知，一次提取已經(jīng)基本上將米糠中的甾醇全部提取，多次提取成本增加，故試驗均提取一次。

2.3 Plackett-Burman設(shè)計篩選米糠甾醇提取率重要影響因子

按照1.3.1的試驗步驟，對超聲波時間（A）、料液比（C）、超聲波功率（D）、顆粒度（E）、超聲波溫度（G）、提取次數(shù)（H）六個因素外加兩個虛擬列B列和F列進行考察，每個因素取低水平“-1”和高水平“1”，響應(yīng)值為米糠甾醇提取率Y。試驗設(shè)計安排與結(jié)果見表3，因素效應(yīng)見表4。

Pr值小于0.05表明此因素對試驗結(jié)果影響顯著，Pr值小于0.01表明此因素對試驗結(jié)果影響極顯著。利用SAS8.1軟件的二水平設(shè)計分析因素的主效應(yīng)，根據(jù)表4的結(jié)果，選擇超聲波時間、超聲波溫度、料液比、超聲波功率及顆粒度為正交優(yōu)化試驗的五個主要影響因素。

2.4 正交試驗結(jié)果及分析

在單因素試驗及Plackett-Burman設(shè)計篩選的基礎(chǔ)上選擇選擇超聲波時間、超聲波溫度、料液比、超聲波功率及顆粒度為正交優(yōu)化試驗的五個主要影響因素，以提取率為指標(biāo)，選擇L16（45）設(shè)計表進行，正交結(jié)果見表5。

由表5可知影響米糠甾醇提取率的因素大小順序為：料液比>超聲波功率>超聲波時間>超聲波溫度>顆粒度，與Plackett-Burman設(shè)計篩選的結(jié)果一致。最佳提取工藝為：超聲波時間70min，超聲波溫度60℃，料液比1：25g/mL，超聲波功率150W，顆粒度60目，為了驗證此條件是否為最佳工藝組合，進行三次平行提取試驗，三次試驗的提取率分別為4.1893mg/g、4.1035mg/g、4.1563mg/g，取其平均值4.1497mg/g為此條件下的提取率。此條件下的提取率高于正交中的任何組合，因此確定其為最佳工藝。

3 結(jié)論

Plackett-Burman設(shè)計試驗?zāi)茉谳^多影響因子中篩選出對實驗影響顯著的因素，有效減少試驗次數(shù)及強度。通過正交優(yōu)化得出超聲波輔助提取米糠甾醇的最佳提取工藝條件：超聲波時間70min，超聲波溫度60℃，料液比1：25g/mL，超聲波功率150W，顆粒度60目，此條件下的提取率為4.1497mg/g。影響米糠甾醇提取率的因素大小順序為：料液比>超聲波功率>超聲波時間>超聲波溫度>顆粒度。參考文獻（略）