硒對馬鈴薯試管苗生長和GSH-PX活性的影響

朱云芬，向極釬，殷紅清，程 群，徐 怡

(1.恩施州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北 恩施 445002；2.恩施州硒應(yīng)用技術(shù)與產(chǎn)品開發(fā)研究院，湖北 恩施 445002)

硒對馬鈴薯試管苗生長和GSH-PX活性的影響

朱云芬1,2，向極釬1,2，殷紅清1,2，程 群1，徐 怡1

(1.恩施州農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北 恩施 445002；2.恩施州硒應(yīng)用技術(shù)與產(chǎn)品開發(fā)研究院，湖北 恩施 445002)

以MS為基本培養(yǎng)基，以鄂馬鈴薯5號脫毒試管苗為試驗材料，研究不同濃度亞硒酸鈉(Na2SeO3)溶液對馬鈴薯試管苗生長和谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-PX)活性的影響.結(jié)果表明：Na2SeO3質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)為5 mg/L時，馬鈴薯試管苗的長勢較好，GSH-PX活性相對較高，Na2SeO3質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)高于5 mg/L時，對GSH-PX活性及組培苗的生長有不同程度的抑制作用，到40 mg/L時生長完全受到抑制，基本停止生長，表明只有適當(dāng)?shù)奈鴿舛炔拍茉鰪?qiáng)GSH-PX活性，促進(jìn)生長.

硒；馬鈴薯；試管苗；谷胱甘肽過氧化物酶；酶活力

硒(Se)是地球上的一種稀少的元素，是人和動物體內(nèi)的必需微量元素之一，直接參與機(jī)體重要的抗氧化酶-谷胱甘肽過氧化物酶(Glutathione peroxidase, GSH-Px)的組成，硒的生物學(xué)作用主要是通過硒蛋白發(fā)揮作用.從硒的生物學(xué)作用來看，目前比較確定的功能主要有：抗氧化、防衰老；增強(qiáng)免疫；保證精子的活力；預(yù)防腫瘤；參與激素的代謝；防治克山病、大骨節(jié)??；預(yù)防血管疾病如動脈粥樣硬化；抗病毒；拮抗重金屬離子的毒性等.人體缺硒會造成癌癥、心血管疾病、白內(nèi)障、高血壓、甲狀腺腫大、免疫缺失、關(guān)節(jié)炎等40多種威脅人類健康的疾病，被譽(yù)為“生命的火種”、“抗癌之王”、“心臟的守護(hù)神”等.

全世界有40多個國家和地區(qū)屬于缺硒地區(qū).我國是一個缺硒大國，從東北三省起斜穿至云貴高原，占我國國土面積的72%地區(qū)存在一條低硒地帶，其中30%為嚴(yán)重缺硒地區(qū)，華北、東北、西北等大中城市都屬于缺硒地區(qū)[1].營養(yǎng)學(xué)專家經(jīng)過反復(fù)實驗得出，人體中血硒的含量標(biāo)準(zhǔn)值為0.10 mg/kg，低于此值就會發(fā)生缺硒癥[2].而我國有29%地區(qū)人均含硒量在0.02 mg/kg以下，定為極度缺硒地區(qū)，有43%的地區(qū)人體含硒值在0.03～0.04 mg/kg之間，為缺硒地區(qū)[3].中國營養(yǎng)學(xué)會推薦的成年人攝硒量為50～250 mg/d，人體中硒主要從日常飲食中獲得，食物中硒的含量直接影響了人們?nèi)粘Ｎ臄z入量.因此，開發(fā)利用富硒產(chǎn)品已成為當(dāng)前的一項迫切任務(wù).

馬鈴薯(SolariumtuberosumL)屬茄科茄屬，具有豐富的營養(yǎng)，適應(yīng)性強(qiáng)，產(chǎn)量高，產(chǎn)業(yè)鏈長，是一種糧、菜、飼料及工業(yè)原料兼用型高產(chǎn)高效作物.馬鈴薯是世界第四大糧食作物，其種植面積和產(chǎn)量僅次于小麥、水稻和玉米.據(jù)統(tǒng)計，目前我國馬鈴薯的栽培面積約在500萬hm2以上，占世界的1/4，總產(chǎn)量在8 500萬t左右，占世界的1/5，我國已成為世界上馬鈴薯種植面積最大的國家[4]，馬鈴薯在我國國民經(jīng)濟(jì)增長中占有重要地位.

在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中把硒肥作為微肥施用是增產(chǎn)和改善農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)的一項重要措施.國內(nèi)已經(jīng)在水稻等多種蔬菜上做了大量的富硒研究，現(xiàn)在已經(jīng)證明，噴施硒肥均可以有效提高其產(chǎn)量和含硒量, 有研究發(fā)現(xiàn)在一定的硒肥噴施濃度和噴施時期下，馬鈴薯的塊莖產(chǎn)量和含硒量均有顯著提高[5]，但硒對馬鈴薯組培苗生長及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)活性影響還未見報道.本研究旨在探索硒對馬鈴薯組培苗生長發(fā)育及其GSH-Px活性的影響，以提出合理的馬鈴薯施硒技術(shù)，促進(jìn)馬鈴薯的生長發(fā)育，提高馬鈴薯的抗逆性，為進(jìn)一步開發(fā)利用富硒馬鈴薯提供理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試植物材料為鄂馬鈴薯5號脫毒試管苗，由恩施州農(nóng)業(yè)科學(xué)院馬鈴薯研究所提供.

表1 亞硒酸鈉不同處理對馬鈴薯脫毒試管苗表型性狀的影響Tab.1 Influence of different treatment of Na2SeO3 on potato plantlets in vitro phenotypic traits

1.2 試驗方法

1.2.1 材料培養(yǎng) 篩選生長較一致的脫毒試管苗，將其剪切成帶一個腋芽、長約1 cm的莖段，接種到培養(yǎng)基上進(jìn)行亞硒酸鈉的單因子試驗.以MS為基本培養(yǎng)基，亞硒酸鈉的濃度設(shè)置為0、5、10、20、30、40 mg/L，培養(yǎng)基中均加入6 g/L瓊脂，80 g/L蔗糖，pH調(diào)為5.8～6.0，配制后高壓滅菌20 min.在每支試管內(nèi)接種3個莖段，每個處理設(shè)3次重復(fù)，每重復(fù)10支.培養(yǎng)條件為：工作時間16h/d，光照強(qiáng)度2 000 lx，溫度(22±2)℃.

1.2.2 生長發(fā)育指標(biāo)測定 接種后的第30 d，從每個處理隨機(jī)抽取3支試管，調(diào)查莖長、莖粗、葉片、根數(shù)、根長等表型性狀，計算平均值，重復(fù)3次.

1.2.3 谷胱甘肽過氧化物酶活性測定 GSH-Px的測定參照李合生的間接法II，根據(jù)GSH與5,5’-二硫代對二硝基苯甲酸(DTNB)反應(yīng)生成黃色的5-硫代-2-硝基苯甲酸陰離子，在423 nm處有最大吸光值，計算該離子的濃度，即可計算出GSH減少的量，測出GSH-Px的活性.

取馬鈴薯試管苗0.5 g于預(yù)冷的研缽中，加入0.2 mol/L磷酸緩沖液(含1 mmol/L EDTA-Na2，5%的水溶性PVP，pH6.2)10 mL，冰浴中研磨成勻漿，4 000 r/min離心10 min，取上清液于12 000 r/min離心5 min，取上清液供酶活力測定用.取上述酶液各0.4 mL，分別注于酶管和非酶管中，并將非酶管加熱使酶失活，分別加入1.0 mmol/L GSH 0.4 mL和經(jīng)37℃預(yù)熱的1.5 mmol/L H2O20.2mL，立即于37℃下反應(yīng)3 min，再在2支試管中加入1.67%的偏磷酸沉淀液4.0 mL，2 000r/min離心10 min,保留上清液.另取2支試管分別加入上述清液2.0 mL，再取1支試管加雙蒸水0.4 mL和1.67%的偏磷酸沉淀液1.6 mL作為空白管，并在這3支試管中各加入0.32 mol/L Na2HPO42.5 mL和DTNB 0.5 mL，反應(yīng)5 min，在412 nm下比色讀取OD值.酶活性單位為μ/(g·min).酶活計算公式為：植物GSH-PX活力(U/mL)=([GSH]酶管-[GSH]非酶管)/(A×反應(yīng)時間×酶反應(yīng)液的體積×植株質(zhì)量)，其中A為標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率.酶活力定義:1 mL反應(yīng)液中，37℃每分鐘催化1μ mol GSH氧化的酶量為一個酶活力單位.

2 結(jié)果與分析

2.1 Na2SeO3不同濃度處理對馬鈴薯試管苗生長的影響

馬鈴薯組培苗莖段在對照和低濃度的Na2SeO3培養(yǎng)基上培養(yǎng)，在6～7 d全部萌芽，當(dāng)其濃度大于10 mg/L時，萌芽時間推遲4～7 d左右.由表1顯示，試管苗生長30 d時，在5 mg/L硒處理條件下，除莖粗外，組培苗的莖長，根數(shù)、根長和葉片數(shù)均高于對照，這表明添加適當(dāng)濃度的硒鹽能促進(jìn)試管苗的生長.而在添加Na2SeO310～40 mg/L濃度范圍內(nèi)，試管苗的生長情況隨濃度的變化有顯著的差異，隨著Na2SeO3濃度的增加, 莖長逐漸變小、莖粗變細(xì)、根數(shù)變少、根長變小、葉片數(shù)變少，葉片呈黃綠色，長勢變?nèi)酰忻黠@的抑制作用，直至40 mg/L硒鹽處理時馬鈴薯試管苗生長完全受到抑制，基本停止生長.

圖1 馬鈴薯不同處理條件下GSH-Px的酶活比較

2.2 Na2SeO3不同濃度處理對馬鈴薯試管苗GSH-Px活性的影響

用Na2SeO3處理馬鈴薯試管苗30 d時，如圖1所示，與0 mg/L對照相比，馬鈴薯試管苗GSH-PX活力在5 mg/L硒處理時增長最快，達(dá)到130 μ/(g·min)，比對照增加了80.6%.而隨著Na2SeO3濃度的繼續(xù)增大，GSH-Px活力則呈下降趨勢，10～30 mg/L Na2SeO3濃度處理時，其GSH-Px活力均高于對照，當(dāng)濃度達(dá)到40 mg/L時， GSH-Px活力低至50 μ/(g·min)，低于對照，這可能是由于隨著Na2SeO3處理濃度的變大， 過高濃度的硒對有機(jī)體產(chǎn)生了毒性，反而抑制了GSH-Px活性.

3 小結(jié)與討論

分析硒鹽脅迫有關(guān)的馬鈴薯組培苗生長及GSH-Px酶活性的結(jié)果顯示：Na2SeO3濃度為5 mg/L時，馬鈴薯組培苗的生長勢較好，GSH-Px活性相對較高，Na2SeO3濃度高于5 mg/L時 ，對GSH-Px活性及組培苗的生長有不同程度的抑制作用，到40 mg/L時生長完全受到抑制，基本停止生長，表明只有適當(dāng)?shù)奈鴿舛炔拍茉鰪?qiáng)GSH-Px活性，促進(jìn)生長.

谷胱甘肽過氧化物酶( Glutathione peroxidase,GSH-Px) 是Mills等[6]1957年首次從牛紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的，1973年Rotruck等[7]證明GSH-Px為含硒酶.至1985年Drotar等[8]才在植物組織中檢測到GSH-Px的活性.近年來，從衣藻和高等植物中也分離得到類似硒代半胱氨酸殘基的GSH-Px基因[9-10].Fu等[11]以衣藻為材料并利用分子生物學(xué)和生物化學(xué)技術(shù)研究了編碼GSH-Px基因的UGA終止密碼子處同樣存在一個硒代半胱氨酸，這與報道的動物含硒GSH-Px有較大的相似性.植物體內(nèi)的GSH-Px可能由多種家族成員組成，其家族成員可能在進(jìn)化的不同時期以及不同的脅迫被招募來控制不同的發(fā)育途徑和防御反應(yīng).從現(xiàn)有的研究結(jié)果來看，不同的環(huán)境脅迫(如病原菌侵染、高鹽和重金屬等)下，表達(dá)GSH-Px的mRNA水平將穩(wěn)步提高[12]，暗示了GSH-Px在增加植物抗性以及耐脅迫方面具有重要作用.郭靜成等[13]研究硒對高等植物中谷胱甘肽過氧化物酶活性的影響，發(fā)現(xiàn)微量元素硒對高等植物中GSH-Px 活性影響是非常明顯的，并推測高等植物中存在活躍的GSH-Px，在一定硒濃度范圍內(nèi)，硒對該酶活性增加有明顯的促進(jìn)作用，超過一定硒濃度則酶活力下降，而且植物生長也受到抑制，這種現(xiàn)象可能與硒的毒害有關(guān)，這與本試驗的結(jié)果也是一致的，也為進(jìn)一步研究植物的硒積累水平及耐受硒脅迫的機(jī)制奠定了基礎(chǔ).

[1]原中共中央地方病防領(lǐng)導(dǎo)小組辦公室和中國科學(xué)院環(huán)境科學(xué)委員會.中華人民共和國地方疾病與環(huán)境因素圖集[M].北京：科學(xué)出版社,1989.

[2]楊光圻.人的硒需要量研究[J].中國地方病學(xué)雜志，1989(5):298.

[3]環(huán)境與地方病組.克山病與自然環(huán)境和硒營養(yǎng)背景[J].營養(yǎng)學(xué)報，1982,4(3):175-182.

[4]陳伊里,屈冬玉.馬鈴薯產(chǎn)業(yè)與冬作農(nóng)業(yè)[M].哈爾濱，哈爾濱工程大學(xué)出版社,2006:1-35.

[5]黃景新,秦聽.硒肥對馬鈴薯塊莖產(chǎn)量及含硒量的影響[J].馬鈴薯雜志,1999，13(2):94-95.

[7]Rotruck J T,Pope A L,Ganther H E,et al.Biochemical role as a component of glutathione peroxidase[J].Science,1973,179:588-590.

[6]Mills G C,Hemoglobin catabolism,I.Glutethione peroxidase,an erythrocyte emzyme uchich protects hemoglobin from oxidative breakdoun[J].J Biol Chem,1957,229(1):189-197.

[8]Drotar A,Phelps A,Fall R.Evidence for Glutathione Peroxidase Activity In CμLtured Plant Cells[J].Plant Science,1985,42:35-40.

[9]Yokota A,Shigeoka S,Onishi T,et al.Selenium as inducer of glutathione peroxidase in low-CO2grown Chlamydomonas reinhardtii[J].Plant Physiology,1988,86:649-651.

[10]Shigeoka S,Takeda T, Hanaoka T.Characterization and immunological properties of seleniumcontaining glutathione peroxidase induced byselenite in Chlamydomonas reinhardtii[J].Biochemical Journal,1991,275:623-627.

[11]Fu LH,Wang XF,Eyal Y, et al.A selenoprotein in the plant kingdom[J].Journal of Biological Chemistry,2002,277:25983-25991.

[12]苗雨晨,白玲,苗琛,等.植物谷胱甘肽過氧化物酶研究進(jìn)展[J].植物學(xué)通報,2005,22(3):350-356.

[13]郭靜成,尹順平.硒對高等植物中谷胱甘肽過氧化物酶活性及谷胱甘肽含量的影響[J].西北植物學(xué)報,1998,18(4):533-537.

責(zé)任編輯：高山

EffectofSeleniumonPotatoPlantletsGrowthandGSH-PXActivity

ZHU Yun-fen1,2，XIANG Ji-qian1,2，YING Hong-qing1,2，CHENG Qun1,2，XU Yi1,2

(1.Enshi Academy of Agricultural Sciences，Enshi 445002，China；2. Enshi Selenium Institute of Applied Technology and Product Development，Enshi 445002，China)

Using MS as the basic medium and virus-free plantlets of E-malingshu 5 as the experimental materials,we research the effect of different Na2SeO3concentration on the growth of potato plantlets in vitro and the influence of glutathione peroxidase activity. The results showed that when Na2SeO3concentration was 5mg/L plantlets grew well and GSH-PX activity is relatively high，when the Na2SeO3concentration is higher than 5 mg/L，had inhibition effect in different degree on the growth of the plantlets and the activity of GSH-PX，the growth was completely inhibited when concentrations reached 40 mg/L，and the plantlets basically stopped growing,which showed that only the appropriate concentration can enhance the GSH-PX activity and promote growing.

Selenium; potato;plantlet; glutathione peroxidase; enzyme activity

2013-12-16.

湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心基金項目(2010NKY028).

朱云芬(1982- )，女，碩士，農(nóng)藝師，主要從事植物組織培養(yǎng)及分子生物學(xué)研究.

Q946

A

1008-8423(2014)01-0024-03