miR-196b、miR-25在兒童急性髓細(xì)胞白血病中的表達(dá)及臨床意義

徐麗華, 胡紹燕, 岑建農(nóng), 楊乃超, 洪 丹

(1. 蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院 血液腫瘤科, 江蘇 蘇州, 215003;2. 蘇州大學(xué)附屬第一醫(yī)院，江蘇省血液病研究所血液科, 江蘇 蘇州, 215006;3. 江蘇省連云港市第一人民醫(yī)院 兒科, 江蘇 連云港, 222002)

兒童急性髓細(xì)胞白血病(AML)是兒童造血系統(tǒng)髓源細(xì)胞惡性增殖性疾病，作為一種高度異質(zhì)性疾病，其發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)多基因多步驟異常的過(guò)程[1]。盡管根據(jù)國(guó)際先進(jìn)治療組的報(bào)道，其5年生存率已上升到了55%～65%[2], 但AML患兒的治療反應(yīng)和預(yù)后受多種因素影響，誘導(dǎo)失敗和復(fù)發(fā)仍時(shí)有發(fā)生。傳統(tǒng)的用于判斷預(yù)后的細(xì)胞遺傳學(xué)存在一定的缺陷，探索新的分子遺傳學(xué)改變對(duì)預(yù)后的意義日趨重要。

微小RNA(以下簡(jiǎn)稱(chēng)microRNA /miRNA/miR)是一種內(nèi)源性的非編碼小分子RNA(長(zhǎng)約22nt), 在轉(zhuǎn)錄后水平參與著人類(lèi)約1/3基因的調(diào)控，影響著細(xì)胞的增殖、分化、凋亡，發(fā)揮著“促癌“或“抑癌”作用[3]。先前的諸多研究[4]已經(jīng)報(bào)道了miRNA表達(dá)失控與成人AML的關(guān)系，例如，miR-25的表達(dá)與成人AML的總體生存率(OS)顯著相關(guān)(P<0.05)。但迄今為止，對(duì)于miRNA在兒童AML中作用的研究尚不多?；谏镄畔W(xué)分析結(jié)果，作者選擇了miR-196b、miR-25作為研究對(duì)象，利用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)法，檢測(cè)了這三種miRNA在兒童初診AML和非白血病對(duì)照組兒童之間的表達(dá)差異，并結(jié)合臨床資料分析其意義，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

以本院2012年3月—2013年12月確診為AML的20例初診患兒作為研究對(duì)象，其中男5例，女15例，年齡12～157個(gè)月，中位年齡81.5個(gè)月。20例AML患兒診斷均經(jīng)臨床及血常規(guī)、骨髓象及免疫組織化學(xué)染色等實(shí)驗(yàn)室檢查確診，部分患兒行染色體核型分析、29種融合基因篩查、AML突變組套檢測(cè)、FISH檢測(cè)，符合急性髓細(xì)胞白血病MIC (形態(tài)學(xué)細(xì)胞化學(xué)、免疫學(xué)、細(xì)胞遺傳學(xué)) 分型診斷依據(jù)。根據(jù)國(guó)際通用的FAB分類(lèi)法進(jìn)行亞型分類(lèi)，20例AML患兒中M2、M3、M4、M5、M6分別為4例、1例、6例、8例和1例。所有初診AML患兒均采用2006年全國(guó)兒童AML化療方案[5]。同期納入20例非白血病兒童作為對(duì)照組。根據(jù)兒童急性髓細(xì)胞白血病診療建議[5], 進(jìn)行危險(xiǎn)度分組，低、中、高危組分別為5例、4例、11例。

1.2 方法

1.2.1 主要實(shí)驗(yàn)設(shè)備與試劑: 人淋巴細(xì)胞分離液(Ficoll)(上海華精高科技生物有限公司); TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit (美國(guó)ABI公司); TaqMan 2×Universal PCR Master Mix, 5 mL(美國(guó)ABI公司); TaqMan MicroRNA Assays(20×)(美國(guó) ABI 公司)(探針引物序列由ABI公司設(shè)計(jì)合成，編號(hào)分別為: hsa-miR-196b: 002215-PN4427975; hsa-miR-25: 002442-PN4427975; U6snRNA: 001973-PN4427975); Thermo3.2全波長(zhǎng)酶標(biāo)儀; ABI 9700 PCR反應(yīng)儀; ABI 7500熒光定量PCR儀等。

1.2.2 標(biāo)本采集: 抽取初診時(shí)化療前實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組兒童的骨髓2 mL, 肝素抗凝，標(biāo)本采集后立即用Ficoll法分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，加Trizole充分裂解后，凍存于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 總RNA抽提、濃度測(cè)定及調(diào)整: Trizole法統(tǒng)一提取總RNA, 酶標(biāo)儀測(cè)定RNA濃度并用DEPC水調(diào)整至4 ng/μL濃度，置于冰盒準(zhǔn)備反轉(zhuǎn)錄。

1.2.4 miRNA反轉(zhuǎn)錄反應(yīng):按照美國(guó)ABI公司提供的TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit說(shuō)明書(shū)操作步驟，應(yīng)用ABI 9700PCR反應(yīng)儀反轉(zhuǎn)錄分別合成2種miRNA的cDNA。逆轉(zhuǎn)錄參數(shù)條件設(shè)置: 16 ℃ 30 min, 42 ℃ 30 min, 85 ℃ 5 min, 4 ℃ forever, 共1個(gè)循環(huán)。

1.2.5 qRT-PCR分析:上述反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物先用管家基因ABL進(jìn)行熒光定量PCR反應(yīng)(設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn))，以驗(yàn)證RNA抽提及反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)品質(zhì)量，ABL定量結(jié)果顯示均在104拷貝數(shù)以上，提示標(biāo)本及產(chǎn)品質(zhì)量良好；然后進(jìn)行miR-196b、miR-25, 和內(nèi)參U6的莖環(huán)qRT-PCR檢測(cè)。設(shè)置反應(yīng)條件：50 ℃ 2 min滅活UNG酶, 95 ℃10 min預(yù)變性, 95 ℃ 15 s, 60 ℃ 60 s, 共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)標(biāo)本采用三復(fù)孔。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)中每個(gè)標(biāo)本設(shè)三個(gè)復(fù)孔，結(jié)果分析時(shí)，要求同一標(biāo)本復(fù)孔Ct值相差≤0.5，內(nèi)參U6的Ct值≤25, 否則棄去；擴(kuò)增曲線(xiàn)結(jié)果分析設(shè)定手動(dòng)Ct閾值為0.08; 以U6 snRNA為內(nèi)參基因, miR-196b、miR-25的相對(duì)表達(dá)量以公式2-△△Ct表示(計(jì)算△△Ct時(shí)，對(duì)照組△Ct取其中位數(shù))。得到的基因表達(dá)數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)為非正態(tài)分布的定量資料，故采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行非參數(shù)檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)處理，兩獨(dú)立樣本秩和檢驗(yàn)用于兩組獨(dú)立樣本之間差異的比較，多重獨(dú)立樣本之間的比較采用K個(gè)獨(dú)立樣本秩和檢驗(yàn)，雙變量相關(guān)分析用于比較兩組定量資料之間的相關(guān)性。結(jié)果分別以秩均值或中位數(shù)表示，同時(shí)采用GraphPad Prism 5軟件進(jìn)行繪圖。以P<0.05 判定為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miRNA表達(dá)水平在AML患兒和對(duì)照組間的比較

在骨髓單個(gè)核細(xì)胞中，2種miRNA的表達(dá)水平見(jiàn)表1。miR-196b的相對(duì)表達(dá)量在患者和對(duì)照組間有顯著差異(P=0.017)，AML患兒的miR-196b表達(dá)水平高于對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05), miR-25似乎在患者組降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.245)。見(jiàn)圖1。

表1 AML患兒與對(duì)照組兒童兩種miRNA的表達(dá)水平比較(中位數(shù)M)

圖1 miR-196b、miR-25在病人組和對(duì)照組間的相對(duì)表達(dá)對(duì)比

2.2 miRNA表達(dá)水平與臨床資料之間的關(guān)系

2.2.1 miRNA表達(dá)水平與危險(xiǎn)度分組的關(guān)系: 在危險(xiǎn)度分組的兩兩比較中, miR-196b在高危組、中危組和低危組之間的秩均值分別為13.40、8.25、4.60, 表達(dá)水平有顯著差異(χ2=8.642,P=0.013), 高危組miR-196b表達(dá)水平最高，低危組最低。miR-25在不同危險(xiǎn)度分組之間無(wú)顯著差異(P=0.129)。見(jiàn)圖2。

2.2.2 miRNA表達(dá)水平與治療反應(yīng)(一療程是否緩解)的關(guān)系:以d26骨髓幼稚細(xì)胞比例<5%為一療程緩解組，≥5%為一療程未緩解組, miR-25表達(dá)水平的秩均值分別為9.80和4.40，兩組間有顯著差異(Z=-2.205,P=0.027)，在一療程緩解組miR-25的表達(dá)水平顯著增高。而miR-196b的表達(dá)水平在2組間無(wú)顯著差異(P=0.205)。

2.2.3 miRNA表達(dá)水平與初診白細(xì)胞分組的關(guān)系：在WBC<10萬(wàn)/mm3和WBC≥10萬(wàn)/mm3兩組間, miR-196b表達(dá)水平的秩均值分別為8.00和14.33, 2組間有顯著差異(Z=-2.280,P=0.023), 在WBC≥10萬(wàn)/mm3組miR-196b的表達(dá)水平較高。而miR-25的表達(dá)水平在2組間無(wú)顯著差異(P=0.101)。

2.2.4 miRNA表達(dá)水平與初診LDH的關(guān)系以及初診白細(xì)胞計(jì)數(shù)之間的關(guān)系: miR-25相對(duì)表達(dá)量與初診LDH數(shù)值之間呈負(fù)相關(guān)(r=-0.511,P=0.021), 隨著LDH水平的增高, miR-25表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。而在miR-196b的表達(dá)水平與初診時(shí)LDH數(shù)值無(wú)顯著相關(guān)(P>0.05); 血清LDH濃度與初診白細(xì)胞計(jì)數(shù)呈正相關(guān)(Spearman相關(guān)系數(shù)r=0.0.851，P<0.001)。兩個(gè)miRNA的表達(dá)水平與初診白細(xì)胞計(jì)數(shù)無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)。

2.2.5 miRNA表達(dá)水平與細(xì)胞遺傳學(xué)特點(diǎn)的關(guān)系:在染色體核型預(yù)后良好組和預(yù)后不良組間, miR-196b表達(dá)水平的秩均值分別為4.33和8.67, 具有顯著差異(Z=-2.082,P=0.037), 提示預(yù)后不良組miR-196b表達(dá)水平增高；而miR-25表達(dá)水平的秩均值分別為9.14和4.50, 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-2.143,P=0.032)；在預(yù)后不良核型組呈低表達(dá)現(xiàn)象。

2.2.6 miRNA表達(dá)水平與AML患兒其他臨床資料之間的關(guān)系:miR-196b、miR-25的表達(dá)水平在不同性別分組間無(wú)顯著差異(P>0.05)，與年齡、WBC計(jì)數(shù)、幼稚細(xì)胞、CRP、FAB分型等初診時(shí)臨床資料無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)。

3 討 論

自1993年Lee等[6]首次發(fā)現(xiàn)miRNA以來(lái)，這種長(zhǎng)度序列高度保守的小分子從此開(kāi)啟了生物學(xué)界研究的新領(lǐng)域。通過(guò)調(diào)控不同的下游靶基因[7], miRNA不僅參與白血病的形成，而且影響其治療反應(yīng)和預(yù)后。本研究中，作者利用qRT-PCR方法分析后發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于對(duì)照組來(lái)說(shuō)，初診AML患兒的miR-196b具有明顯高表達(dá)現(xiàn)象，而miR-25表達(dá)水平與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

miR-196b定位于HOX基因簇，在兒童ALL中與HOX基因表達(dá)量呈正相關(guān)性[8], 其功能主要是提高造血祖細(xì)胞的存活和增殖能力[9], 在MLL重排和NPM1突變陽(yáng)性的兒童AML中，miR-196b表達(dá)增加[10]。高表達(dá)的miR-196b與成人AML不良預(yù)后相關(guān)[4]。本研究結(jié)果顯示，在不同的危險(xiǎn)度分組之間，miR-196b的表達(dá)水平具有顯著差異，尤其在高危組和低危組之間差異明顯(P=0.013), 與上述報(bào)道相符。在比較染色體核型不良組和核型良好組以及WBC<10萬(wàn)/mm3和WBC≥10萬(wàn)/mm3組之間的表達(dá)水平后發(fā)現(xiàn)，miR-196b在核型不良組和WBC≥10萬(wàn)/mm3組表達(dá)水平明顯增高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.037和0.023)。眾所周知，細(xì)胞遺傳學(xué)異常是一個(gè)經(jīng)典的預(yù)后相關(guān)因素，而初診時(shí)WBC≥10萬(wàn)/ mm3是評(píng)估AML患兒危險(xiǎn)度的高危因素之一。由此可見(jiàn)，miR-196b是一種與危險(xiǎn)度和預(yù)后密切相關(guān)的小分子RNA。至于miR-196b在兒童AML的生物學(xué)進(jìn)程中是如何發(fā)揮作用的，作者尚不清楚。近期兩個(gè)有關(guān)AML的體外研究已經(jīng)證實(shí)了miR-196b的外源性高表達(dá)可以導(dǎo)致髓系分化部分受阻和髓系造血祖細(xì)胞增殖上調(diào)[11-12]。

迄今為止，關(guān)于miR-25的研究相對(duì)較少，現(xiàn)有的研究大多集中于實(shí)體瘤方面。例如在結(jié)直腸癌中，miR-25是一個(gè)特異敏感的預(yù)后標(biāo)記物[13]，而在胃癌患者的血漿中miR-25明顯增高，是早期胃癌診斷的一種非侵入性標(biāo)記物[14]。本研究中，與對(duì)照組相比, miR-25在AML患兒中未發(fā)現(xiàn)明顯差異表達(dá)，但結(jié)合臨床資料分析后發(fā)現(xiàn)，miR-25表達(dá)水平在誘導(dǎo)一療程緩解組和未緩解組之間以及染色體核型良好組和不良組之間具有顯著差異(P=0.027, 0.032)[15]。目前，AML患兒早期治療反應(yīng)備受重視，誘導(dǎo)一療程緩解情況，已被公認(rèn)能夠預(yù)測(cè)病人的預(yù)后和轉(zhuǎn)歸，miR-25在一療程緩解組和染色體核型良好組的高表達(dá)現(xiàn)象提示miR-25與AML患兒的預(yù)后相關(guān)[16]，高表達(dá)miR-25的患兒對(duì)誘導(dǎo)治療敏感，可能與良好預(yù)后相關(guān)；在對(duì)20例AML患兒的臨床資料進(jìn)行回顧性分析后，作者還發(fā)現(xiàn)，初診血清LDH濃度與初診白細(xì)胞計(jì)數(shù)呈正相關(guān)(r=0.851,P<0.001), 而初診miR-25表達(dá)水平與初診LDH呈負(fù)相關(guān)(r=0.511,P=0.021)[17]。眾所周知，初診時(shí)高白細(xì)胞的患兒預(yù)后較差，而LDH在一定程度上代表著體內(nèi)腫瘤負(fù)荷，這也提示miR-25與預(yù)后的相關(guān)性，在兒童AML的生物學(xué)進(jìn)程中，miR-25可能發(fā)揮著潛在的抑癌活性或協(xié)同抑癌作用，影響著治療反應(yīng)及預(yù)后，其機(jī)制有待于進(jìn)一步的研究[18]。

總之，通過(guò)莖環(huán)qRT-PCR方法，我們初步研究了miR-196b、miR-25在兒童初診AML中的表達(dá)及意義，證實(shí)了在兒童初診AML中miR-196b的差異表達(dá)現(xiàn)象及其與預(yù)后的相關(guān)性，與成人AML的研究結(jié)果不盡相同，也許在兒童AML中miRNA有著不同的生物學(xué)特性，下一步作者將擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步深入研究。未來(lái)有必要在這些miRNAs參與兒童AML生物學(xué)進(jìn)程的機(jī)制方面進(jìn)行全方位的研究。不遠(yuǎn)的將來(lái)，這些表達(dá)失控的miRNAs不僅可能成為強(qiáng)有力的早期診斷和評(píng)估預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)記物，按照Garzon R等設(shè)想的思路[19]，或許還將成為兒童AML治療的新靶點(diǎn)新方向。

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