養(yǎng)真接骨膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

焦寧 楊劼 馬華民 韓麗

·藥物研究·

養(yǎng)真接骨膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究

焦寧 楊劼 馬華民 韓麗

中藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；藥品檢驗(yàn)

養(yǎng)真接骨膠囊是我院研制的純中藥制劑，由黃瓜子、自然銅、制川烏、乳香、沒藥、川芎、續(xù)斷、土鱉蟲、紅花、骨碎補(bǔ)等組成，具有補(bǔ)腎壯骨、止痛、活血化瘀、續(xù)筋接骨的功效，能加速成骨、促進(jìn)骨折愈合。過去中藥制劑只要求定性檢測(cè)而不要求定量檢測(cè)，為了更好的控制藥品質(zhì)量及滿足最新制劑規(guī)范的要求，我們進(jìn)行了養(yǎng)真接骨膠囊的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究。本研究以中醫(yī)藥理論為指導(dǎo)，結(jié)合現(xiàn)代分析技術(shù)，以骨碎補(bǔ)中的有效成分柚皮苷[1]的含量為指標(biāo)，并輔以其他藥味薄層鑒別研究，來評(píng)價(jià)該藥的質(zhì)量；本品中含有中藥制川烏，其成分烏頭堿是毒性成分，因此對(duì)其進(jìn)行了限量檢查。

1 材料與儀器

1.1 材料 養(yǎng)真接骨膠囊(由河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院制劑室提供)；對(duì)照品、對(duì)照藥材均購自中國藥品生物制品檢定所。試劑：甲醇(色譜純，美國天地)、乙腈(色譜純，美國天地)、水(超純水,18.2MΩ.cm )。

1.2 主要儀器 LC-15C高效液相色譜儀(島津)；SIL-10AF自動(dòng)進(jìn)樣器；CTO-15C柱溫箱；SPD-15C紫外檢測(cè)器；Shimadzu工作站；UPH-I-20L超純水制造系統(tǒng)(成都超純科技有限公司)。電子分析天平(AG135)。硅膠G(青島海洋化工廠)。

2 質(zhì)量控制方法

2.1 薄層色譜條件

2.1.1 續(xù)斷的薄層色譜鑒別：取本品內(nèi)容物3 g，加甲醇50 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液揮干，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，作為供試品溶液。另取續(xù)斷對(duì)照藥材3 g，同法制成對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法(中國藥典2010年版一部附錄VI B)試驗(yàn)，吸取上述供試品溶液10 μl、對(duì)照藥材溶液5 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上。以正丁醇-乙酸-水(4∶1∶5)上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干。噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的主斑點(diǎn)，重現(xiàn)性良好，陰性無干擾。

2.1.2 乳香的薄層色譜鑒別：取本品內(nèi)容物3 g，加乙醚50 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液揮干，殘?jiān)右宜嵋阴? ml使溶解，作為供試品溶液。另取乳香對(duì)照藥材0.2 g，加乙酸乙酯1 ml使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法(中國藥典2010年版一部附錄VI B)試驗(yàn)，吸取上述兩種溶液各10 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以石油醚(60～90℃)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%的香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的主斑點(diǎn)，重現(xiàn)性良好，陰性無干擾。

2.1.3 土鱉蟲的薄層色譜鑒別：取土鱉蟲對(duì)照藥材2 g，加甲醇30 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液揮干，殘?jiān)蛹状? ml使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法(中國藥典2010年版一部附錄VI B)試驗(yàn)，吸取“2.1.1”項(xiàng)下供試品溶液10 μl、上述對(duì)照藥材溶液10 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上。以甲苯-三氯甲烷-丙酮(5∶5∶0.5)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的主斑點(diǎn)，重現(xiàn)性良好，陰性無干擾。

2.1.4 川芎的薄層色譜鑒別：取川芎對(duì)藥材0.5 g，加乙醚30 ml，超聲處理15 min，濾過，濾液加乙酸乙酯1 ml使溶解，作為對(duì)照藥材溶液。照薄層色譜法(中國藥典2010年版一部附錄VIB)試驗(yàn)，吸取“2.1.2”項(xiàng)下供試品溶液10 μl、上述對(duì)照藥材溶液5 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯(9∶1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365 nm)下檢視。供試品色譜中，在與對(duì)照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的主斑點(diǎn)，重現(xiàn)性良好，陰性無干擾。

2.2 制川烏中烏頭堿的限量檢查 取本品內(nèi)容物3 g，加濃氨試液4 ml，拌勻，放置2 h，加乙醚40 ml，振搖，放置24 h，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)訜o水乙醇溶解并轉(zhuǎn)移至2 ml容量瓶中,加無水乙醇定容至刻度，作為供試品溶液。另取烏頭堿對(duì)照品，加無水乙醇制成每1 ml含1 mg的溶液,作為對(duì)照品溶液。照薄層色譜法(中國藥典2010年版一部附錄VIB)試驗(yàn)，吸取供試品溶液5 μl、對(duì)照品溶液4 μl，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正已烷-乙酸乙酯-乙醇-濃氨(6.5∶3.5∶1∶0.1)為展開劑，置氨蒸氣飽和的層析缸內(nèi)展開，取出，晾干，噴以稀碘化鉍鉀溶液。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上，出現(xiàn)的斑點(diǎn)應(yīng)小于對(duì)照品的斑點(diǎn)。

2.3 含量測(cè)定方法

2.3.1 供試品溶液的制備：取本品10粒，除去膠囊殼，精密稱定，置索氏提取器中，加100 ml乙醚提取2 h，棄去乙醚提取液，殘?jiān)稍锖蠹?00 ml甲醇提取4 h，回收甲醇，剩余適量轉(zhuǎn)移至25 ml量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。

2.3.2 HPLC法測(cè)定養(yǎng)真接骨膠囊中柚皮苷含量的方法學(xué)考察

2.3.2.1 色譜條件：流動(dòng)相：wondasil ODS色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm；日本島津)；柱溫35℃；乙腈：水(30:70)；檢測(cè)波長212 nm；流速1 ml/min。

2.3.2.2 對(duì)照品溶液的制備：精密稱取柚皮苷對(duì)照品15.00 mg,置50 ml容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，即得，濃度為300 μg/ml。

2.3.2.3 專屬性考察：按處方比例稱取除骨碎補(bǔ)外的其它藥材，照制備工藝制得缺骨碎補(bǔ)的陰性樣品，按供試品溶液制備方法進(jìn)行制備，得到缺骨碎補(bǔ)的陰性樣品溶液。分別取對(duì)照品溶液、供試品溶液和陰性對(duì)照溶液10 μl，注入液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)行分析，得相應(yīng)的色譜圖，比較各色譜圖。結(jié)果陰性樣品溶液色譜圖中未檢出柚皮苷吸收峰，表明在本實(shí)驗(yàn)條件下柚皮苷專屬性良好，峰形良好，無雜質(zhì)峰干擾，結(jié)果見圖1。

Fig.1 Specific test of Naringin

2.3.2.4 線性關(guān)系考察：分別取對(duì)照品溶液1，2，3，4，5，6 ml，置10 ml量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，搖勻配制成濃度分別為30、60、90、120、150、180 μg/ml的溶液，分別精密吸取10 μl，注入液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)行分析，測(cè)定其峰面積，以對(duì)照品進(jìn)樣量(μg)(x)為橫坐標(biāo)，峰面積積分值(y)為縱坐標(biāo)，求得回歸方程，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。柚皮苷回歸方程為：y=2334.8x+9171(n=6，r=0.9999)，線性范圍為300～1 800 μg，最低定量限為標(biāo)準(zhǔn)曲線最低點(diǎn)300 μg。

2.3.2.5 精密度試驗(yàn)：精密吸取對(duì)照品溶液和供試品溶液各10 μl，注入液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)行分析，測(cè)定6次，記錄峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果顯示柚皮苷對(duì)照品峰面積平均值為2823117，RSD為0.30%，供試品峰面積平均值為2009259，RSD為0.33%，表明儀器精密度良好。

2.3.2.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)：精密吸取對(duì)照品溶液10 μl和供試品溶液各10 μl，于0、2、4、8、12、24 h注入液相色譜儀，按上述色譜條件進(jìn)行分析，記錄峰面積，計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果顯示，柚皮苷對(duì)照品在24 h內(nèi)峰面積穩(wěn)定，RSD為0.27%，供試品在24 h內(nèi)峰面積穩(wěn)定，RSD為0.41%。

2.3.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)：取同一批樣品，設(shè)高、中、低三個(gè)濃度(1.5∶1∶0.5)，每個(gè)濃度平行3份，按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備，測(cè)定峰面積，計(jì)算平均含量及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。結(jié)果表明，高、中、低三個(gè)不同濃度的RSD為0.95%，表明方法重復(fù)性良好。

2.3.2.8 回收率試驗(yàn)：采用加樣回收率試驗(yàn)，取同一批樣品設(shè)高、中、低三個(gè)濃度，每個(gè)濃度平行3份，各濃度水平加入對(duì)照品的量與所取供試品含量之比分別為1∶1.5、1∶1、1∶0.5。按“2.2.1”項(xiàng)下方法制備，測(cè)定峰面積，計(jì)算回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差。由加樣回收試驗(yàn)結(jié)果可知，平均回收率為98.06%，RSD為4.08%，表明該方法準(zhǔn)確可靠。

3 討論

本制劑為十味藥材的復(fù)方制劑，我們逐一進(jìn)行了薄層鑒別研究，建立了七味藥材的鑒別方法，鑒別方法專屬性強(qiáng)，處理過程簡單，能有效控制制劑的質(zhì)量。

骨碎補(bǔ)主要含有黃酮類化合物[2]，柚皮苷為其主要有效成分[1]。柚皮苷的含量測(cè)定多采用甲醇-醋酸-水體系，本研究嘗試甲醇-醋酸-水(40∶3∶60)[3]、甲醇-水-冰醋酸(35∶65∶4)[4]、甲醇-水-冰醋酸(35∶65∶0.3)[5]等比例，最終確定應(yīng)用2010版藥典記載方法，甲醇-醋酸-水(34∶4∶65)作為流動(dòng)相。本方法分析時(shí)間短、準(zhǔn)確、靈敏、重復(fù)性好。

1 王雪妮,張德芹.骨碎補(bǔ)外用功能主治研究進(jìn)展.中國醫(yī)藥導(dǎo)報(bào),2012,9:13-14,17.

2 尚振蘋,趙慶春,譚菁菁,等.骨碎補(bǔ)的化學(xué)成分.實(shí)用藥物與臨床,2010 13:262-263,277.

3 伍奕,蔣曉煌,蔣孟良,等.骨碎補(bǔ)中柚皮苷含量測(cè)定方法的優(yōu)化研究.湖南中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào),2010,30:48-50.

4 張靜赟,劉戰(zhàn)宏,宋愿智.高效液相色譜法測(cè)定接骨續(xù)筋片中柚皮苷的含量.醫(yī)藥導(dǎo)報(bào).2009,28:366-367.

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10.3969/j.issn.1002-7386.2014.04.057

050051 石家莊市，河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院藥劑科

R 927.1

A

1002-7386(2014)04-0604-02

2013-08-21)