強直性脊柱炎中血清高遷移率族蛋白B1和腫瘤壞死因子α的表達與疾病相關(guān)性的研究

宋海澄,宋 丁,于 萍,王 健,王潔蕊,舒 榮,韓依軒, 楊文浩,袁 偉 劉白鷺,李 娜, 崔劉福*

(1.河北聯(lián)合大學附屬開灤總醫(yī)院 風濕免疫科,河北 唐山063000;2.吉林大學中日聯(lián)誼醫(yī)院 風濕免疫科，吉林 長春130033)

強直性脊柱炎(Ankylosing Spondylitis,AS)是一種以骶髂關(guān)節(jié)、脊柱炎癥和骨壞死伴發(fā)新骨形成的慢性炎癥性疾病，通常發(fā)生在中軸骨骼，進行性加重導致關(guān)節(jié)強直和功能喪失。TNF-α在炎性關(guān)節(jié)疾病中的作用已為人們所熟知，并且TNF-α抑制劑已成功用于AS的臨床治療。盡管如此，仍有40%患者不能達到臨床緩解[1]，這就促使人們開始探索是否還有其他的炎癥因子參與AS的發(fā)生和發(fā)展，以期找到新的治療靶點。高遷移率族蛋白B1(HMGB1)是一種間接反映感染、損傷、炎癥的有效的致炎因子[2]。在關(guān)節(jié)炎動物模型中已經(jīng)證實HMGB1的水平升高[3]。并且向?qū)嶒炇箨P(guān)節(jié)內(nèi)注射HMGB1可誘發(fā)關(guān)節(jié)炎[4]。這些證據(jù)均表明HMGB1在關(guān)節(jié)炎發(fā)病機制中可能起著重要的作用。另外，對HMGB1信號轉(zhuǎn)導通路的研究發(fā)現(xiàn)，HMGB1與TNF-α之間存在瀑布效應的級聯(lián)反應而導致炎癥不斷放大。所以，我們檢測了AS患者和健康人群外周血中HMGB1和TNF-α的水平，以期探討HMGB1在AS發(fā)病中的作用以及與TNF-α關(guān)系，為AS發(fā)病機制的研究及尋找新的治療靶點提供理論依據(jù)。

1 對象和方法

1.1對象

本研究共納入AS患者50例，均來自河北聯(lián)合大學附屬開灤總醫(yī)院住院和門診病人。患者疾病活動采用Bath AS Disease Activity Index (BASDAI；0-10)評分，BASDAI評分≥4表示疾病活動。軀體功能測定采用Bath Ankylosing Spondylitis Functional Index (BASFI；0-10)評分。所有病例HLA-B27均陽性，并符合1984年美國風濕病學會修訂的紐約標準，并除外其他自身免疫性疾病、肝腎疾病、感染、惡性腫瘤及血液系統(tǒng)疾病。其中首診未經(jīng)治療的疾病活動期患者30例(男25例，女5例；平均年齡28.2±8.8 歲)。首診經(jīng)治3個月且無病情活動者20例(男17例，女3例，平均年齡28.4±10.6歲)，其中7例接受依納西普聯(lián)合緩解病情藥物(DMARDs)治療，9名患者接受非甾體抗炎藥(NSAIDs)聯(lián)合DMARDs治療，4名患者接受糖皮質(zhì)激素(研究期間，強的松5-7.5 mg/D)聯(lián)合DMARDs治療。從同地區(qū)選取性別、年齡和種族與疾病組匹配的正常志愿者30例作為健康對照(男性26人，女性4人；平均年齡29.7±10.5歲)，無免疫性疾病，無高血壓、冠心病、糖尿病等慢性疾病，超敏C反應蛋白(hsCRP)、血沉(ESR)、血小板計數(shù)(Plt)、白細胞計數(shù)、血脂、血糖、肝功能、腎功能檢測結(jié)果均在參考范圍內(nèi)，HLA-B27均呈陰性。本研究已通過河北聯(lián)合大學附屬開灤總醫(yī)院倫理委員會同意且所有納入研究者均簽署知情同意書。

1.2研究方法

所有研究對象均清晨空腹采靜脈血5 ml，留取血清-20°C凍存?zhèn)溆?。采用ELISA雙抗夾心法測定三組研究對象血清 HMGB1和 TNF-α的水平，按照試劑盒(R&D Systems,Minneapolis,MN,USA)說明書操作。血清 ESR 采用魏氏方法檢測，血清hsCRP 采用日立7600 自動生化分析儀檢測，采用 SYSMEX -XT1800 全自動血細胞計數(shù)儀檢測血常規(guī)。

1.3統(tǒng)計分析

2 結(jié)果

2.1 活動期、穩(wěn)定期AS患者與正常組比較WBC計數(shù)、Hb、RBC計數(shù)無統(tǒng)計學差異；活動期及穩(wěn)定期患者血小板計數(shù)與正常組比較均明顯升高，且有統(tǒng)計學意義；血沉、hsCRP穩(wěn)定期較活動期患者明顯降低，兩組患者與正常組比較升高，且均有統(tǒng)計學意義；BASFI、BASDAI穩(wěn)定期較活動期患者明顯降低且有統(tǒng)計學意義(見表1)。

表1 研究對象的一般資料

*與穩(wěn)定期AS患者比較，P<0.001；△與正常組比較，P<0.001；※與正常組比較，P<0.05

2.2 AS患者血清HMGB1的表達與正常組比較明顯升高，經(jīng)治療穩(wěn)定期患者較未治療活動期患者血清學水平明顯降低。

所有入組AS患者血清HMGB1水平明顯高于正常對照組(W= 238.00，P<0.001，見表2)；初診未經(jīng)治療活動期的AS患者HMGB1水平較正常組明顯增高(W= 96.00，P<0.001，見表2)；經(jīng)治療穩(wěn)定期AS患者較活動期患者則明顯下降(W= 133.00，P<0.001，見表2)，但仍高于健康對照組(W=142.00，P<0.002見表2)。

2.3 AS患者血清TNF-α的表達與正常組比較明顯升高，且經(jīng)過治療后血清學水平明顯降低。

全部AS患者TNF-α血清水平明顯高于正常對照(t=5.080，P<0.001見表3)；初診未經(jīng)治療活動期和經(jīng)治療穩(wěn)定期的AS患者TNF-α水平較正常組AS患者明顯增高(t=7.038，P<0.001；t=2.977，P<0.005見表2)；但經(jīng)治療穩(wěn)定期的AS患者血清TNF-α水平較未經(jīng)治療初診患者明顯下降(t=4.004，P<0.001見表2)。

2.4 AS患者血清HMGB1和TNF-α水平呈正相關(guān)(r=0.811)，統(tǒng)計學差異具有顯著性，P<0.001。AS患者血清中HMGB1和TNF-α水平與炎性指標血沉(r=0.428，0.534)和hsCRP(r=0.515，0.519)以及軀體功能指數(shù)BASFI(r=0.521，0.568)和疾病活動指數(shù)BASDAI(r=0.493，0.564)均呈明顯的正相關(guān)，統(tǒng)計學差異具有顯著性，P<0.001；而二者與患者的年齡、病程、白細胞、血小板均無相關(guān)性，P>0.05。

表2 強直性脊柱炎患者不同疾病活動程度以及正常組血清HMGB1水平的比較，M(P25，P75)

*與正常對照組比較；#與穩(wěn)定期患者比較。

表3 強直性脊柱炎患者不同疾病活動程度以及正常組血清TNF-α水平的比較，

*與正常對照組比較；#與穩(wěn)定期患者比較。

表4 強直性脊柱炎患者臨床特征與血清HMGB1、TNF-α水平的相關(guān)系數(shù)

**P<0.001

3 討論

高遷移率族蛋白B1(HMGB1)是廣泛存在于真核細胞的細胞核內(nèi)的一種高度保守的非組蛋白DNA結(jié)合蛋白，單核巨噬細胞在受到炎性刺激后，能夠主動使位于核內(nèi)的HMGB1轉(zhuǎn)移至胞漿，并可通過蛋白質(zhì)非經(jīng)典分泌途徑將其分泌到細胞外[2]。另外，壞死細胞也可以被動釋放HMGB1[5]。在細胞外，HMGB1是一種重要的炎癥介質(zhì)和致炎因子，是啟動和維持炎癥瀑式反應的中心分子，介導多種急慢性炎癥性疾病。在HMGB1信號轉(zhuǎn)導機制的研究[6,7]中發(fā)現(xiàn)，HMGB1依賴于RAGE信號轉(zhuǎn)導途徑，激活NF-κB[6,8]，使NF-κB由細胞質(zhì)移位至核內(nèi)，啟動多種炎癥因子轉(zhuǎn)錄，從而引起多重促炎癥反應。另外HMGB1可以通過活化Toll樣受體2(TLR-2)和Toll樣受體4(TLR-4)引起髓性分化因子88(MyS88)和IL-1受體相關(guān)的激酶(IRAK)的修復，繼而激活MAPK途經(jīng)和NF-κB的核轉(zhuǎn)位，最終導致炎癥反應產(chǎn)生[7]?？梢?，HMGB1作為一個致炎因子，在細胞因子瀑布效應和功能前反饋機制中促使下游炎癥反應的發(fā)生。另一方面，TNF-α的分泌，也可以促進HMGB1的釋放,從而形成惡性循環(huán)，造成瀑布式的級聯(lián)反應，使炎癥不斷的擴大和加重，導致疾病發(fā)生。

AS是一種骨破壞伴新骨形成導致脊柱強直和功能損傷的慢性炎癥性疾病。近年來已證實TNF-α是許多慢性炎癥的早期致炎因子。已有大量證據(jù)表明TNF-α在AS的發(fā)病過程中起著至關(guān)重要的作用，且作為治療的靶點在臨床治療中已收到了很大的效果。我們的研究結(jié)果顯示，與健康對照組比較HMGB-1和TNF-α在AS患者中都是高表達的。而對活動期和穩(wěn)定期AS患者的HMGB-1和TNFα水平比較發(fā)現(xiàn)，穩(wěn)定期二者血清水平明顯下降。相關(guān)分析發(fā)現(xiàn)，HMGB1和TNFα血清水平與炎性指標ESR和hsCRP以及疾病活動指數(shù)BASDAI和功能指數(shù)BASFI呈明顯的正相關(guān)，因此，我們可以推斷HMGB-1可能參與了AS的致病過程，且表達水平與疾病活動相關(guān)。

HMGB1對TNF-α表達水平影響的分子作用機制的探討中發(fā)現(xiàn)HMGB1對TNF-α合成具有直接調(diào)節(jié)效應[9]； HMGB1可刺激人單核/巨噬細胞系分泌大量的細胞因子TNF-α，且TNF-α的釋放與HMGB1刺激濃度間有顯著的劑量依賴性關(guān)系，并且HMGB1刺激TNF-α合成的動力學特點具有延遲性和反應雙相性[10]，這一特點對于炎癥反應的維持和延長具有重要作用。本研究對AS患者血清HMGB-1和TNF-α水平相關(guān)分析顯示，二者呈明顯的正相關(guān)，由此提示AS的活動期，增高的HMGB1可能通過激活NF-κB的核轉(zhuǎn)位，引起TNF-α的大量釋放，從而導致了關(guān)節(jié)炎癥的加重。HMGB1作為一種刺激TNF-α釋放的前炎癥因子，是否可以通過抗HMGB1治療，抑制NF-κB信號轉(zhuǎn)導途徑，減少TNF-α的釋放，從而減輕AS疾病的嚴重程度，為AS的治療提供新的途徑。

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