人乳頭瘤病毒E6/E7 mRNA檢測(cè)在宮頸病變篩查中的應(yīng)用價(jià)值

張生枝,邵華江,馬建婷

(1.寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院，浙江 寧波315211；2.寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬陽(yáng)明醫(yī)院 婦產(chǎn)科，浙江 余姚315400)

眾所周知，人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是宮頸癌發(fā)生和發(fā)展的首要因素。近年來(lái)，HPV DNA聯(lián)合細(xì)胞學(xué)檢測(cè)用于宮頸病變的篩查，顯著降低了宮頸癌的發(fā)生率，但HPV DNA只是病因檢測(cè)，對(duì)病毒的活動(dòng)程度及病變程度無(wú)法判斷，從而使其不能預(yù)測(cè)宮頸病變的進(jìn)展及進(jìn)行風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估。由于E6和E7是HPV的癌基因，其表達(dá)產(chǎn)物E6和E7蛋白是致癌的關(guān)鍵，因而E6/E7 mRNA體現(xiàn)了HPV致癌基因活動(dòng)程度。本研究對(duì)TCT剩余標(biāo)本行HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)，與HPV DNA檢測(cè)進(jìn)行比較，以探討其在宮頸病變篩查中的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1一般資料

2012年6月至2013年4月在余姚市人民醫(yī)院因?qū)m頸炎癥、陰道異常出血或排液門(mén)診患者720例，年齡23-80歲，平均年齡43.7歲。均有性生活史，無(wú)宮頸物理治療及手術(shù)史，無(wú)盆腔放射史，均排除妊娠，3d內(nèi)無(wú)陰道沖洗及用藥。以病檢結(jié)果正常、炎癥、CIN1患者為對(duì)照組，CIN2+(CIN2、CIN3、宮頸癌)患者為觀察組。

1.2方法

1.2.1 TCT檢查 采用TCT專用毛刷取材，將宮頸管內(nèi)和鱗柱上皮交界處采集的細(xì)胞涮洗在TCT專用取樣瓶中，經(jīng)TCT專用制片機(jī)制成薄層涂片，經(jīng)巴氏染色后鏡檢。宮頸細(xì)胞學(xué)診斷按照國(guó)際癌癥協(xié)會(huì)推薦的TBS(2001)分類法。

1.2.2 HPV DNA檢測(cè) 采用PCR反向點(diǎn)雜交技術(shù)。所用HPV專用毛刷、細(xì)胞保存液、試劑盒和儀器均購(gòu)自深圳亞能生物技術(shù)有限公司。采用HPV專用毛刷取材，將鱗柱上皮交界處和宮頸管采集的細(xì)胞涮洗在HPV專用取樣瓶中。嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。

1.2.3 組織病理學(xué)檢查 TCT≥ASC-US或(和)高危HPV DNA陽(yáng)性的患者行HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)和陰道鏡下宮頸活檢。宮頸組織病理學(xué)診斷分為：正常或炎癥、宮頸上皮內(nèi)瘤變(CIN)、浸潤(rùn)癌(ICC)。對(duì)病檢結(jié)果≥CIN1的患者行子宮頸電環(huán)切除(LEEP)或冷刀錐切術(shù)(CKC)，以獲取進(jìn)一步病理診斷。若不同部位有不同級(jí)別診斷，以病理級(jí)別最高者作為最后診斷。

1.2.4 HPV E6/E7 mRNA檢測(cè) 采用TCT剩余標(biāo)本，試劑盒和儀器均購(gòu)自河南中美合資科蒂亞生物技術(shù)有限公司(Kodia Biotechnology Inc)。實(shí)驗(yàn)人員只記錄標(biāo)本編號(hào)，事先不知曉標(biāo)本診斷，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行操作。加入試劑處理后的標(biāo)本采用QuantiVirusTM冷光儀檢測(cè)。檢測(cè)結(jié)果為光子數(shù)，經(jīng)計(jì)算軟件轉(zhuǎn)換為拷貝數(shù)，≥1copy/ml為陽(yáng)性。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 13．0軟件，計(jì)數(shù)資料用χ2檢驗(yàn)；以受試者工作特征(ROC)曲線下面積(AUC)作為評(píng)價(jià)篩查方法的準(zhǔn)確性，ROC曲線采用MedCalc分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1TCT、HPVDNA、HPVE6/E7mRNA及病理檢查結(jié)果

720名患者中，TCT結(jié)果為NILM者531例(73.8%)，ASC-US 80例(11.1%)，LSIL 44例(6.1%)，ASC-H 9例(1.3%)，HSIL 54例(7.5%)，AGC 2例(0.3%)，；HPV DNA陽(yáng)性者254例(35.3%)，其中高危型HPV(HR-HPV)陽(yáng)性者243例，低危HPV(LR-HPV)陽(yáng)性者11例；TCT≥ASC-US或(和)HR-HPV DNA陽(yáng)性者274例，均行宮頸HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)和病理學(xué)檢查。病檢結(jié)果與TCT、HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)結(jié)果關(guān)系見(jiàn)表1。

表1 病檢結(jié)果與 TCT、HR-HPV DNA、HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)結(jié)果關(guān)系[ n(%)]

注：≥ASC-H包括ASC-H、HSIL、AGC、宮頸癌。

在CIN和ICC中，HPV E6/E7 mRNA總體陽(yáng)性率為78.7%(170/216)，低于HPV DNA總體陽(yáng)性率92.6%(200/216)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.949，P<0.001)。從表1可見(jiàn)，隨著宮頸病變級(jí)別的升高，HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性率也隨之升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=12.851，P<0.01)。但在CIN2+(CIN2、CIN3、ICC)中，HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.435，P>0.05)。

2.2HPVE6/E7mRNA、HPVDNA檢測(cè)對(duì)CIN2+的診斷結(jié)果及診斷價(jià)值

見(jiàn)表2、表3。HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)診斷CIN2+的靈敏度為83.0%，低于HPV DNA(94.5%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=10.994，P<0.01)；特異度為51.1%，高于HPV DNA(22.8%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=14.579，P<0.001)；陽(yáng)性預(yù)測(cè)值為77.0%，高于HPV DNA(70.8%)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=1.876，P>0.05)；陰性預(yù)測(cè)值為60.3%，低于HPV DNA(67.7%)，差異也無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=0.259，P>0.05)。

2.3HPVE6/E7mRNA、HPVDNA檢測(cè)診斷CIN2+的ROC曲線，

見(jiàn)圖1。對(duì)于診斷CIN2+，HPV E6/E7 mRNA、HPV DNA的ROC曲線下面積分別為0.670(95%可信區(qū)間0.611～0.726)、0.587(95%可信區(qū)間0.526～0.646)。經(jīng)Z檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=3.165，P<0.01)，可見(jiàn)，HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)診斷CIN2+的準(zhǔn)確性高于HPV DNA檢測(cè)，但兩者準(zhǔn)確性均較低。

表2 HPV E6/E7 mRNA、HPV DNA檢測(cè)與病理檢查診斷結(jié)果

表3 HPV E6/E7 mRNA、HPV DNA檢測(cè)對(duì)CIN2+的診斷價(jià)值

圖1 HPV E6/E7 mRNA、HPV DNA檢測(cè)診斷CIN2+的ROC曲線

3 討論

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，高危型HPV持續(xù)感染是宮頸癌發(fā)生發(fā)展的首要因素。Walboomers等[1]研究發(fā)現(xiàn)，幾乎100%宮頸癌標(biāo)本中可檢測(cè)到HPV，可見(jiàn)HPV檢測(cè)對(duì)宮頸癌篩查有重要意義。2003年美國(guó)食品與藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)HPV檢測(cè)聯(lián)合細(xì)胞學(xué)檢查用于30歲以上婦女的宮頸癌篩查。但HPV DNA檢測(cè)只是病因?qū)W診斷，不能判斷宮頸HPV感染階段以及病毒癌基因的活性。因此，需采取更為有效的HPV檢測(cè)進(jìn)行宮頸癌的早期篩查。

HPV早期編碼區(qū)中E6、E7基因是病毒癌基因，病毒DNA一旦整合進(jìn)入宿主細(xì)胞DNA，E6、E7基因?qū)⒉皇芸刂频馗叨缺磉_(dá)，增加到引起宮頸細(xì)胞惡化的水平[2]。E6、E7基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物E6/E7 mRNA反映了癌基因活性，通過(guò)對(duì)E6/E7 mRNA檢測(cè)，不必重復(fù)進(jìn)行HPV檢測(cè)即能判斷HR-HPV反復(fù)感染[3]。研究證實(shí)E6/E7 mRNA表達(dá)是宮頸癌發(fā)生發(fā)展的必經(jīng)步驟，2006年歐洲生殖器感染和腫瘤研究組織(European Research Organization on Genital Infection and Neoplasia，EUROGIN)取得了共識(shí)，認(rèn)為HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)應(yīng)作為重點(diǎn)研究對(duì)象[4]。Ratman等[5]研究發(fā)現(xiàn)隨著宮頸病變的加重，HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性率也隨之增加。本研究發(fā)現(xiàn)HPV E6/E7 mRNA在CIN1、CIN2、CIN3、ICC中陽(yáng)性率分別為55.9%、80.0%、83.6%、89.7%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；但在CIN2+中，HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與Shen[6]等報(bào)道一致，但與Szarewski等[7]報(bào)道不一致。由于CIN2、CIN3常作為高級(jí)別宮頸上皮內(nèi)病變，需要有創(chuàng)操作進(jìn)行干預(yù)[4]，因而本研究以CIN2+作為宮頸病變的研究對(duì)象。對(duì)于診斷CIN2+，本研究發(fā)現(xiàn)HPV E6/E7 mRNA特異度(51.1%)高于HPV DNA(22.8%)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，且通過(guò)ROC曲線分析，其準(zhǔn)確性也高于HPV DNA(P<0.01)，可見(jiàn)HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)較HPV DNA更精準(zhǔn)、更直接，可以更為準(zhǔn)確地篩選出高危人群以及監(jiān)測(cè)宮頸病變的發(fā)生發(fā)展。但HPV E6/E7 mRNA靈敏度為83.0%，漏診率為17.0%，且其對(duì)診斷CIN2+準(zhǔn)確性仍欠理想，因此，筆者并不建議其單獨(dú)應(yīng)用于宮頸癌的篩查，可考慮將其與細(xì)胞學(xué)聯(lián)合檢測(cè)或?qū)⑵渥鳛槎€篩查手段。Cattani等[2]研究表明宮頸脫落細(xì)胞HPV E6/E7 mRNA檢測(cè)可評(píng)估宮頸病變進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)，本研究中18例HR-HPV DNA陽(yáng)性而細(xì)胞學(xué)正常的患者中檢測(cè)到E6/E7 mRNA，表明E6/E7 mRNA在宮頸細(xì)胞發(fā)生改變前就已經(jīng)有表達(dá)，比細(xì)胞學(xué)能更早預(yù)測(cè)病變進(jìn)展的風(fēng)險(xiǎn)。但是，對(duì)于HR-HPV DNA與HPV E6/E7 mRNA陽(yáng)性患者病變進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)大小如何仍有待于大樣本隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)的研究。

本研究發(fā)現(xiàn)HPV E6/E7 mRNA在CIN和宮頸癌中的陽(yáng)性率(78.7%)低于HPV DNA(92.6%)，有31例HR-HPV DNA陽(yáng)性的CIN1、CIN2患者未檢測(cè)到E6/E7 mRNA，因大部分CIN1可自行逆轉(zhuǎn)，盡管大部分CIN2向更高級(jí)別病變發(fā)展，但仍有32%CIN2會(huì)自行消退[8]，因而，E6/E7 mRNA陰性可能預(yù)示著疾病逆轉(zhuǎn)。但另一方面，宮頸HPV感染到發(fā)生宮頸癌是一個(gè)漫長(zhǎng)的過(guò)程，在這過(guò)程中，HPV可能處于靜止期，出現(xiàn)病毒癌基因低轉(zhuǎn)錄或無(wú)轉(zhuǎn)錄。因而，對(duì)于HPV DNA陽(yáng)性、E6/E7 mRNA陰性患者仍需長(zhǎng)期隨訪觀察。

早期用于HPV E6/E7 mRNA商業(yè)化臨床檢測(cè)技術(shù)有Aptima技術(shù)、PreTect HPV - Proofer技術(shù)和NucliSENS Easy Q技術(shù)，其中Aptima技術(shù)于2011年通過(guò)了FDA的認(rèn)證。本研究采用的Quantivirus○R技術(shù)為近幾年興起的商業(yè)化檢測(cè)技術(shù)，其原理為支鏈DNA(bDNA)技術(shù)，可同時(shí)檢測(cè)HR-HPV 13種亞型(16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68)和LR-HPV 6種亞型(6、11、40、42、43、44)。由于本研究樣本例數(shù)有限，該方法對(duì)E6/E7 mRNA的檢測(cè)價(jià)值尚有待進(jìn)一步研究，尤其是對(duì)于HR-HPV和HPV E6/E7 mRNA均陽(yáng)性而陰道鏡下活檢正常的患者更需進(jìn)行隨訪觀察。

作者簡(jiǎn)介：張生枝(1987-)，女，碩士研究生，主要研究方向：婦科腫瘤；邵華江，男，寧波大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬陽(yáng)明醫(yī)院婦產(chǎn)科主任，主任醫(yī)師，教授，碩士生導(dǎo)師。

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