黑蘇嘎-25對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷的影響

杜聞博，巴圖烏力吉，佟淑平

(內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院，內(nèi)蒙古 通遼028000)

腦血管疾病(crebrovascular disease，CVD)是指腦血管病變所引起的腦功能障礙。腦血管病變是指由于栓塞和血栓形成導(dǎo)致的血管腔閉塞、血管破裂、血管壁損傷或通透性發(fā)生改變、凝血機(jī)制異常、血液粘度異常或血液成分異常變化引起的疾病，與心臟病、惡性腫瘤構(gòu)成了人類的三大死因[1]。

近年來隨著溶栓治療技術(shù)的發(fā)展，腦缺血后血流重建再灌注性腦損傷的相關(guān)研究己取得了顯著的進(jìn)展，臨床適用的腦保護(hù)和預(yù)處理藥物，應(yīng)具備副作用小，使用方便，患者接受性好等特點(diǎn)。蒙藥 (黑蘇嘎-25)主治脈病、偏癱、半身不遂等臨床療效顯著，主要成分有石決明、麝香、牛黃、木香、肉豆蔻、珍珠粉、犀角、沉香、蓽撥、肉桂、黑種子草、冬葵果、螃蟹、海金砂等，藥理具有良好的抗腦缺血損傷作用。黑蘇嘎-25成份是從天然產(chǎn)物中提取，具有副作用小且作用多途徑、多靶點(diǎn)，可針對(duì)腦缺血性變化的多個(gè)環(huán)節(jié)。

本項(xiàng)目擬采用Zea Longa[2]等的改良的線栓法制備大鼠大腦中動(dòng)脈缺血2 h再灌注24 h模型，以蒙藥(黑蘇嘎-25)進(jìn)行干預(yù)治療，觀察神經(jīng)功能缺損程度，測(cè)定腦梗死體積，檢測(cè)血清中TNF-α、IL-1β表達(dá)水平的變化，揭示黑蘇嘎-25對(duì)實(shí)驗(yàn)性大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用，初步探討其作用機(jī)理，為蒙藥治療腦缺血再灌注損傷提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 試驗(yàn)動(dòng)物 選用健康雄性Wistar大鼠60只，體重約230±20 g，長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司，許可證號(hào)碼:SCXK(吉)-2011-0004。大鼠飼養(yǎng)于適宜溫度及濕度的動(dòng)物室中，處于相同飼養(yǎng)環(huán)境且自由攝食和飲水，自然晝夜(術(shù)前12 h禁食水)。

1.1.2 藥品及主要試劑 黑蘇嘎-25 (0.2 g/粒，內(nèi)蒙古民族大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室生產(chǎn))；腫瘤壞死因子-a試劑盒(上海麗臣生物科技有限公司，美國(guó)進(jìn)口分裝)；白細(xì)胞介素-1β試劑盒(上海麗臣生物科技有限公司，美國(guó)進(jìn)口分裝)；紅四氮唑(氯化-2，3，5-三苯基四氮唑，TTC)：天津市福晨化學(xué)試劑廠；水合氯醛：青島宇龍海藻有限公司。

1.1.3 主要儀器 手術(shù)顯微鏡(吉祥鳥牌，江蘇鎮(zhèn)江中文光學(xué)儀器有限責(zé)任公司)；全自動(dòng)多功能酶標(biāo)儀 (MULTISKANMK3，wELLWASH4MKZ芬蘭)；高速冷凍離心機(jī) (BG10-3A，北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司)；-80℃低溫冰箱(Dw-GLZ18，北京中科美菱低溫科技有限責(zé)任公司)；10 cm眼科剪(YZB/滬1195-04A-2009，上海醫(yī)療器械有限公司手術(shù)器械廠)；電子天平(0.19，上海精密科學(xué)有限公司)；電子天平 (0.000019AUW120D，日本島津制作所試驗(yàn)計(jì)測(cè)事業(yè)部)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(BDR-82，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；顯微手術(shù)器械14 Cm彎直鑷(金鐘牌手術(shù)器械，上海醫(yī)療器械集團(tuán)有限公司手術(shù)器械廠)；醫(yī)用圖像分析系統(tǒng)(BI-2000，成都泰盟科技有限公司)。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組 60只健康雄性Wistar大鼠，雌雄各半，體重約230±20 g，隨機(jī)分成5組，每組12只。

假手術(shù)組：假手術(shù)+生理鹽水灌胃；模型組：缺血再灌注+生理鹽水灌胃；治療組(黑蘇嘎-25高劑量)：缺血再灌注+高劑量黑蘇嘎-25灌胃；治療組(黑蘇嘎-25中劑量)：缺血再灌注+中劑量黑蘇嘎-25灌胃；治療組(黑蘇嘎-25低劑量)：缺血再灌注+低劑量黑蘇嘎-25灌胃。

1.2.2 給藥方法 假手術(shù)組：生理鹽水5 ml/kg·d；模型組：生理鹽水5 ml/kg·d；黑蘇嘎-25高劑量治療組：360 mg/kg·d；黑蘇嘎-25中劑量治療組：180 mg/kg·d；黑蘇嘎-25低劑量治療組：90 mg/kg·d，溶于和假手術(shù)組等體積的生理鹽水，用前搖勻。灌胃(ig)給藥，每天1次，連續(xù)7 d。

1.2.3 腦缺血再灌注損傷模型的制備 模型組與用藥組Wistar大鼠于最后1次灌胃后2 h參照 Zea Longa[2]等的改良的線栓法制備大腦中動(dòng)脈栓塞(MCAO)模型：用10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔麻醉(ip)大鼠，仰位固定，用醫(yī)用碘伏消毒頸前部，在頸正中行長(zhǎng)約2 cm切口，鈍性分離，暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈(Common Carotid Artery ，CCA)和分叉部，分離分叉處的頸外動(dòng)脈(External Carotid Artery ，ECA)和頸內(nèi)動(dòng)脈(Internal Carotid Artery ，ICA)，分離ECA分支枕動(dòng)脈、甲狀腺上動(dòng)脈，依次結(jié)扎CCA近心端、枕動(dòng)脈、甲狀腺上動(dòng)脈，并在遠(yuǎn)心端剪斷枕動(dòng)脈、甲狀腺上動(dòng)脈，在甲狀腺上動(dòng)脈分支之后結(jié)扎頸外動(dòng)脈近心端和遠(yuǎn)心端，自中間剪斷。拉直近心端剪斷的ECA，使ECA與ICA處于同一直線上，微動(dòng)脈夾暫時(shí)性夾閉ICA遠(yuǎn)心端，于ECA距CCA分叉5 mm處附近，在ECA剪一“V”口，將線栓向頸內(nèi)動(dòng)脈顱方向插入16-18 mm(線栓直徑0.24 mm，頭端0.30 mm)，注意不要誤入翼腭動(dòng)脈，可感到阻力而無法向前推進(jìn)時(shí)停止，將線栓固定在ECA上，縫合手術(shù)切口，栓線尾部伸出皮下1 cm左右便于拔栓線，缺血2 h后，外拉栓線0.5 cm，從而實(shí)現(xiàn)24 h再灌注。假手術(shù)組僅暴露左側(cè)頸總動(dòng)脈，其余不做任何處理。

模型成功的標(biāo)志是大鼠左眼出現(xiàn)Horner征；提尾時(shí)右前肢內(nèi)收屈曲；爬行時(shí)向右側(cè)傾倒或按順時(shí)針方向轉(zhuǎn)圈，不成功者予以剔除，并隨機(jī)補(bǔ)充。

1.2.4 標(biāo)本的收集與處理 假手術(shù)組在手術(shù)后2 h，其余各組模型制備成功后，再達(dá)到各自再灌注時(shí)間點(diǎn)24 h時(shí)，經(jīng)10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔麻醉，打開胸腔，腹主動(dòng)脈取血5 ml后，依次用生理鹽水、4%多聚甲醛各200 ml進(jìn)行左心室灌流固定，至流液透明，斷頭取腦，行TTC染色，測(cè)定腦梗死體積。

1.2.5 神經(jīng)功能缺損評(píng)分 參照Longa等[3]的5分制評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)對(duì)麻醉蘇醒后的大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺損評(píng)分：無神經(jīng)病學(xué)征象記為0分；提尾時(shí)病灶對(duì)側(cè)前肢不能完全伸直為1分；向癱瘓側(cè)旋轉(zhuǎn)為2分；向病灶對(duì)側(cè)跌倒為3分；無自發(fā)活動(dòng)及意識(shí)障礙者為4分。評(píng)分為5分、4分和0分的大鼠剔除。

1.2.6 腦梗死體積測(cè)定(TTC染色法，即氯化-2，3，5-三苯基四氮唑染色) 假手術(shù)組在術(shù)后2 h，其余各組在模型制備成功后，達(dá)到各再灌注時(shí)間點(diǎn)24 h時(shí)，每組大鼠以10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔內(nèi)注射深度麻醉，腹主動(dòng)脈取血5 ml后，依次用生理鹽水、4%多聚甲醛各200 ml進(jìn)行左心室灌流固定，至流液透明，迅速斷頭取腦，去除嗅球、小腦和低位腦干，其余用排刀冠狀切成8片，每片厚度約2 mm，置于2%TTC溶液中，37℃電熱恒溫培養(yǎng)箱避光染色30 min，4%多聚甲醛液中固定24 h后數(shù)碼相機(jī)照片后(見圖2)，用醫(yī)用圖像分析系統(tǒng)(BI-2000，成都泰盟科技有限公司)處理照片，測(cè)量腦梗死面積，根據(jù)公式：

V=t(A1+……+A5)

計(jì)算腦梗死體積比，其中t為腦片厚度，A為梗死面積，腦梗死體積比與全腦體積之比為梗死體積百分比。

1.2.7 血清中TNF-α、IL-1β水平的表達(dá) 假手術(shù)組在術(shù)后2 h，其余各組在模型制備成功后，達(dá)到各再灌注時(shí)間點(diǎn)24 h時(shí)，每組大鼠以10%水合氯醛(300 mg/kg)腹腔內(nèi)注射深度麻醉，腹主動(dòng)脈取血5 ml，在4℃冰箱內(nèi)沉淀24 h后，3 000 d/min離心10 min留取上清液，-80℃低溫冰箱保存?zhèn)溆?。根?jù)試劑盒說明書用ELISA法檢測(cè)TNF-α、IL-1β水平。

2 結(jié)果

2.1腦缺血再灌注后神經(jīng)功能缺損評(píng)分

腦缺血2 h，再灌注24 h后，大鼠神經(jīng)功能缺損癥狀主要表現(xiàn)為提尾時(shí)右前肢內(nèi)屈曲收，肌力、肌張力降低，側(cè)推阻力降低，活動(dòng)減少，向右側(cè)追尾轉(zhuǎn)圈，伴或不伴有左側(cè)Horner征。假手術(shù)組無神經(jīng)功能缺損癥狀，評(píng)分均為0分；與假手術(shù)組相比，模型組及治療組(黑蘇嘎-25低劑量、黑蘇嘎-25中劑量、黑蘇嘎-25高劑量)均有明顯的神經(jīng)功能缺損癥狀，具有顯著性差異(P<0.05)；與模型組相比，治療組(黑蘇嘎-25低劑量、黑蘇嘎-25中劑量、黑蘇嘎-25高劑量)神經(jīng)功能缺損程度均有所減輕，并隨著藥物劑量的增加，神經(jīng)功能缺損評(píng)分減少，以黑蘇嘎-25高劑量最為明顯(見表1)，具有顯著性差異，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2黑蘇嘎-25對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷腦梗死體積的影響

假手術(shù)組腦組織呈均勻紅色無梗死灶；模型組和治療組可見梗死蒼白區(qū)域位于右側(cè)額頂葉皮質(zhì)下部和紋狀體外側(cè)區(qū)。與假手術(shù)組相比，模型組及治療組(黑蘇嘎-25高劑量、黑蘇嘎-25中劑量、黑蘇嘎-25低劑量)均有明顯的白色梗死灶，有顯著性差異(P<0.05)；與模型組相比，治療組(黑蘇嘎-25高劑量、黑蘇嘎-25中劑量、黑蘇嘎-25低劑量)均使梗死灶體積減小，以黑蘇嘎-25高劑量最為明顯，(見表1)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3黑蘇嘎-25對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷血清中TNF-α表達(dá)的影響

與假手術(shù)組相比，模型組及治療組(黑蘇嘎-25高劑量、黑蘇嘎-25中劑量、黑蘇嘎-25低劑量)血清中TNF-α水平的表達(dá)明顯升高，有顯著性差異(P<0.05)；與模型組相比，治療組(黑蘇嘎-25高劑量、黑蘇嘎-25中劑量、黑蘇嘎-25低劑量)均使血清中TNF-α水平的表達(dá)降低，以黑蘇嘎-25高劑量最為明顯(見表1)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.4黑蘇嘎-25對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷血清中IL-1β的影響

與假手術(shù)組相比，模型組及治療組(黑蘇嘎-25高劑量、黑蘇嘎-25中劑量、黑蘇嘎-25低劑量)血清中IL-1β水平的表達(dá)明顯升高，有顯著性差異(P<0.05)；與模型組相比，治療組(黑蘇嘎-25高劑量、黑蘇嘎-25中劑量、黑蘇嘎-25低劑量)均使血清中IL-1β水平的表達(dá)降低，以黑蘇嘎-25高劑量最為明顯(見表1)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 腦缺血再灌注后神經(jīng)功能缺損評(píng)分、腦梗死體積、TNF-α、IL-1β表達(dá)的比較

注：a與假手術(shù)組比較P<0.05，b與模型組比較P<0.05。

3 討論

3.1腦缺血再灌注損傷

腦缺血是指腦血流量的減少或血流中斷，再灌注是指腦缺血后血流減少區(qū)域的血流增加或產(chǎn)生血流的復(fù)通。溶栓、抗血小板和抗凝治療后，在血流復(fù)通實(shí)施再灌注的同時(shí)，又會(huì)在某些情況下(如炎癥反應(yīng))加重已缺血細(xì)胞、組織的進(jìn)一步損傷。通過藥物干預(yù)等方法減輕這種損傷程度，可達(dá)到較為理想的治療目的。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果顯示，模型組在缺血2 h，再灌注24 h后，形成了再灌注損傷，表現(xiàn)為出現(xiàn)神經(jīng)功能缺損癥狀，腦組織出現(xiàn)梗死灶及血清中TNF-α、IL-1β水平表達(dá)增強(qiáng)；在治療組，神經(jīng)功能缺損有所減輕，梗死灶體積縮小，血清中TNF-α、IL-1β水平表達(dá)增減弱，達(dá)到了藥物干預(yù)的保護(hù)作用。

3.2黑蘇噶-25的藥理作用

蒙藥民間有許多成方可以治療缺血性腦血管疾病，但蒙醫(yī)臨床上最常用的只有三種：珍寶丸、扎沖十三味和黑蘇噶-25，這三種藥中黑蘇噶-25研究的最少，可能與藥物成分多，利用現(xiàn)代工藝難以提取有效成分，而且價(jià)格昂貴有關(guān)。參照《中國(guó)藥典》2005年版，蒙藥黑蘇嘎-25，性味咸寒，具有解毒，愈傷，除協(xié)日烏素，清腦退翳，主治白脈病，中風(fēng)，偏癱、半身不遂腦傷，協(xié)日烏素病，眼翳白斑，骨折，創(chuàng)傷，頸強(qiáng)等功效[4]。主要成分有石決明、麝香、牛黃、木香、肉豆蔻、珍珠粉、犀角、沉香、蓽撥、肉桂、黑種子草、冬葵果、螃蟹、海金砂等，藥理具有良好的抗腦缺血損傷作用。本實(shí)驗(yàn)通過藥理試驗(yàn)中動(dòng)物間和動(dòng)物與人體間的等效劑量換算表，根據(jù)人的用藥劑量換算出Wistar大鼠的用藥劑量，并以此標(biāo)準(zhǔn)確定為Wistar大鼠用藥的中劑量治療組，此標(biāo)準(zhǔn)二倍就是高劑量，1/2就是低劑量。從而得出黑蘇嘎-25高劑量治療組：360 mg/kg·d；黑蘇嘎-25中劑量治療組：180 mg/kg·d；黑蘇嘎-25低劑量治療組：90 mg/kg·d。

3.3TNF-α與腦缺血再灌注損傷

TNF-α是 Garwell 等在1975年發(fā)現(xiàn)的一種能使腫瘤發(fā)生出血壞死的物質(zhì)，主要由活化的單核-巨噬細(xì)胞分泌，也可以由抗原刺激的 T 細(xì)胞、活化的NK細(xì)胞、肥大細(xì)胞分泌，屬于多肽類激素，具有廣泛的生物學(xué)功能，主要與炎癥及免疫反應(yīng)，研究表明腦缺血早期TNF-α的表達(dá)迅速增加是腦梗死形成的主要原因[5]，主要源于梗死灶的神經(jīng)元、星型細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞等。Liu[6]等人用Northern blot方法觀察到在缺血后1 h缺血側(cè)神經(jīng)元即有TNF-αmRNA的表達(dá),24h達(dá)高峰。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組在大鼠腦缺血2h再灌注24 h時(shí)，TNF-α的含量明顯高于假手術(shù)組，提示腦缺血再灌注過程中TNF-α的表達(dá)水平增加；治療組在大鼠腦缺血2 h再灌注24 h時(shí)，TNF-α的含量明顯低于模型組。說明黑蘇嘎-25能減少腦組織中TNF-α的表達(dá)水平，對(duì)腦缺血再灌注后的損傷具有腦保護(hù)作用。

3.4IL-1β與腦缺血再灌注損傷

IL-1β是IL-1基因家族成員中研究最多的一個(gè)亞類，它是由單核巨噬細(xì)胞合成分泌的強(qiáng)烈趨化因子，廣泛作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞，導(dǎo)致血栓形成，誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞釋放細(xì)胞因子、自由基等促進(jìn)腦缺血后炎癥介質(zhì)的損傷作用，引起神經(jīng)元損傷。IL-1β還能增加細(xì)胞間黏附分子(ICAM-1)在腦缺血中的表達(dá)水平。ICAM-1可介導(dǎo)白細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的緊密黏附，阻塞微血管，降低腦血流。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組在大鼠腦缺血2 h再灌注24 h時(shí)，IL-1β的含量明顯高于假手術(shù)組，提示腦缺血再灌注過程中IL-1β的表達(dá)水平增加；治療組在大鼠腦缺血2 h再灌注24 h時(shí)，IL-1β的含量明顯低于模型組。說明腦缺血再灌注損傷能減少腦組織中IL-1β的表達(dá)水平，對(duì)腦缺血再灌注后的損傷具有腦保護(hù)作用。

3.5黑蘇嘎-25預(yù)處理對(duì)腦缺血再灌注損傷的影響

本實(shí)驗(yàn)取清潔級(jí)健康Wistar大鼠60只，分為假手術(shù)組、模型組、黑蘇嘎-25低劑量組、黑蘇嘎-25中等劑量組、黑蘇嘎-25高劑量組，灌胃給藥7天，制備MCAO大鼠模型，通過行為學(xué)判斷神經(jīng)功能評(píng)分、組織病理學(xué)測(cè)定腦梗死面積、ELISA法檢測(cè)血清中TNF-α、IL-1β水平，結(jié)果顯示，治療組(黑蘇嘎-25高劑量組、黑蘇嘎中劑量組、黑蘇嘎低劑量組)的神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分均較模型組明顯改善，且隨著藥物濃度的增高神經(jīng)功能缺損程度評(píng)分較少；治療組(黑蘇嘎-25高劑量、黑蘇嘎-25中劑量、黑蘇嘎-25低劑量)均較模型組的腦梗死灶體積減小，以黑蘇嘎-25高劑量最為明顯；可見黑蘇嘎-25的應(yīng)用明顯改善了腦缺血的神經(jīng)損傷程度及減少了腦梗死灶體積，對(duì)腦缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用。模型組、治療組(黑蘇嘎-25高劑量、黑蘇嘎-25中劑量、黑蘇嘎-25低劑量)TNF-α陽性細(xì)胞數(shù)量均有增加，說明在缺血性腦損傷過程中，可能是抑制了TNF-α活性而產(chǎn)生明顯的神經(jīng)保護(hù)作用[7]，從而減輕腦缺血再灌注所造成的神經(jīng)功能損傷。治療組(黑蘇嘎-25高劑量、黑蘇嘎-25中劑量、黑蘇嘎-25低劑量)較模型組中的TNF-α、IL-1β陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，證實(shí)黑蘇嘎-25是可能是通過抑制TNF-α、IL-1β表達(dá)的增強(qiáng)來發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。由此可見，抑制TNF-α、IL-1β的表達(dá)，是黑蘇嘎-25對(duì)鼠腦缺血再灌注后腦保護(hù)作用機(jī)制之一。

4 結(jié)論

4.1 黑蘇嘎-25能夠減少局灶性腦缺血大鼠的神經(jīng)功能缺損評(píng)分及縮小局灶性腦缺血大鼠的腦梗死面積，降低局灶性腦缺血后血清中TNF-α、IL-1β水平。

4.2 抑制TNF-α、IL-1β的表達(dá)，可能參與了黑蘇嘎-25對(duì)大鼠腦缺血再灌注損傷后腦保護(hù)作用。

作者簡(jiǎn)介：杜聞博，32歲，男，碩士學(xué)位，醫(yī)師，腦血管?。毁∈缙?，35歲，女，碩士學(xué)位，主治醫(yī)師。

參考文獻(xiàn)：

[1]張振強(qiáng)，宋軍營(yíng)，賈亞泉.缺血性腦血管疾病研究進(jìn)展[J].河南大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版)，2012,31(4):312.

[2]Longa EZ，Weinstein PR，Carlson S，et al.Reversible middlecerebralar teryocclusion without craniectomy in rats[J].Stroke,1989，20(1)：84.

[3]Zea Longa E，Weistein pR，CalsonS，et al.Reversble middle cerebral artery occlusion Without craniectomy in rats[M].Stroek，1989，20(1)：84.

[4]國(guó)家中醫(yī)藥管理局中華本草編委會(huì).中華本草·蒙藥卷[M].上海:上?？茖W(xué)技術(shù)出版社,429．

[5]劉一鷗，金便芬，張林靜，等.腦梗死患者血漿脂聯(lián)素和腫瘤壞死因子-α與病情輕重的關(guān)系[M].中國(guó)全科醫(yī)學(xué)，2007，10(20)：1681.

[6]蔡世昌，白 波，張秋玲.腦缺血再灌注后神經(jīng)細(xì)胞再生研究進(jìn)展[J].解剖學(xué)研究，2012，34(1):54.

[7]劉永琦,吳曉晶,董介正等.補(bǔ)腎方藥血清孵育BMSCs移植對(duì)腦缺血大鼠腦組織細(xì)胞凋亡的影響[J].中國(guó)老年學(xué)雜志,2011,31(3):458.