六周遞增負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)過(guò)程中小鼠免疫平衡的動(dòng)態(tài)觀察*
——流式細(xì)胞儀對(duì)Th1/Th2細(xì)胞的直接檢測(cè)

謝東北,徐凱星,郝選明

(1.贛南師范學(xué)院，江西 贛州 341000； 2.華南師范大學(xué)，廣東 廣州 510631)

六周遞增負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)過(guò)程中小鼠免疫平衡的動(dòng)態(tài)觀察*
——流式細(xì)胞儀對(duì)Th1/Th2細(xì)胞的直接檢測(cè)

謝東北1,徐凱星1,郝選明2

(1.贛南師范學(xué)院，江西 贛州 341000； 2.華南師范大學(xué)，廣東 廣州 510631)

研究目的：以Th1、Th2細(xì)胞為指標(biāo)，觀察遞增負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)過(guò)程中免疫平衡的動(dòng)態(tài)變化。研究方法：雄性8周齡SPF級(jí)昆明小鼠進(jìn)行六周的遞增負(fù)荷游泳訓(xùn)練，每天一次，每周六天。分別在0周、2周、4周和6周取血，流式細(xì)胞術(shù)直接測(cè)定血液Th1、Th2細(xì)胞數(shù)量。研究結(jié)果；六周遞增負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)過(guò)程中Th1細(xì)胞數(shù)量第2周明顯下降，2周、4周呈上升恢復(fù)趨勢(shì)，6周時(shí)基本恢復(fù)到正常； Th2細(xì)胞運(yùn)動(dòng)后2周、4周和6周各組均顯著上升。提示在六周的運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，小鼠的體液免疫功能呈增強(qiáng)趨勢(shì)；在六周的運(yùn)動(dòng)周期中，各個(gè)采樣時(shí)點(diǎn)Th1/Th2比值都顯著下降。研究結(jié)論：六周遞增負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)過(guò)程中,Th1細(xì)胞數(shù)量的下降，同時(shí)Th2細(xì)胞增多。Th1/Th2平衡向Th2一側(cè)極化,提示免疫平衡向體液免疫側(cè)漂移。

免疫平衡；遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)；Th1/Th2；小鼠

1 研究目的

細(xì)胞免疫和體液免疫之間相互聯(lián)系，也相互制約。越來(lái)越多的研究表明，細(xì)胞免疫和體液免疫之間必須維持動(dòng)態(tài)的平衡，如果這種平衡被打破，則將引起病理過(guò)程的發(fā)生。腫瘤[1]、過(guò)敏性疾病[2]、肝炎[3-4]、銀屑癬[5]、妊娠[6]過(guò)程都伴有細(xì)胞免疫和體液免疫的漂移和極化。而且用糾正免疫失衡的辦法，如抑制哮喘病人過(guò)高的IL-4和IL-5(兩者激發(fā)體液免疫)能取得較好的療效[7]。以免疫平衡的視野對(duì)相關(guān)性疾病研究的報(bào)道日益增多[8]。免疫平衡是指免疫反應(yīng)的水平不亢進(jìn)，也不低下；從獲得性免疫的角度分析，免疫平衡指細(xì)胞免疫和體液免疫之間的動(dòng)態(tài)平衡[9]。

Th1介導(dǎo)細(xì)胞免疫，Th2介導(dǎo)體液免疫。細(xì)胞免疫和體液之間的平衡可以用Th1/ Th2細(xì)胞的比值來(lái)表示；也可以用Th1型和 Th2型細(xì)胞因子之比來(lái)表示，但兩者并不完全意義等同，因?yàn)門h1型和 Th2型細(xì)胞因子并不全部由Th1、Th2細(xì)胞所分泌。出于經(jīng)濟(jì)上和實(shí)驗(yàn)技術(shù)上的考量，現(xiàn)在研究免疫平衡多用Th1型和 Th2型細(xì)胞因子，鮮有直接檢測(cè)Th1和Th2細(xì)胞，Th1和Th2細(xì)胞的檢測(cè)更能真實(shí)地反映體內(nèi)免疫平衡的狀態(tài)。

長(zhǎng)期進(jìn)行適量的有氧運(yùn)動(dòng)有助于提高機(jī)體的免疫力，而長(zhǎng)期從事大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練則抑制機(jī)體的免疫力。但鮮有對(duì)比研究運(yùn)動(dòng)對(duì)細(xì)胞免疫和體液免疫產(chǎn)生的不同效應(yīng)。大負(fù)荷和/或高強(qiáng)度的運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練引起的機(jī)體免疫功能異常是不是免疫平衡遭到破壞的表現(xiàn)？細(xì)胞免疫和體液免疫對(duì)不同運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的反應(yīng)和適應(yīng)特征如何？本研究對(duì)此問(wèn)題進(jìn)行初步研究。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象

雄性8周齡SPF級(jí)昆明小鼠64只，每只體重28±2.1g，小鼠分籠飼養(yǎng)，每籠8只。室溫20℃～25℃，相對(duì)濕度45%～70%。用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動(dòng)物飼料飼養(yǎng)，自由進(jìn)食進(jìn)水。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為8組。小鼠合格證號(hào)：SCXK(粵)2008-0020，粵監(jiān)證：F2008A003。

2.2 動(dòng)物分組

動(dòng)物分組要體現(xiàn)機(jī)體液免疫和細(xì)胞免疫功能對(duì)運(yùn)動(dòng)的反應(yīng)和適應(yīng)。按隨機(jī)數(shù)字表隨機(jī)分為8組，每組8只。分組如下：

①第零周訓(xùn)練前基礎(chǔ)值：2組——運(yùn)動(dòng)前安靜組(A)、運(yùn)動(dòng)后即刻組(J)；

②第二周末訓(xùn)練后值：2組(同上)；

③第四周末訓(xùn)練后值：2組(同上)；

④第六周末訓(xùn)練后值：2組(同上)。

表1 動(dòng)物分組情況(只)

2.3 運(yùn)動(dòng)方案

新購(gòu)小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周。小鼠不負(fù)重游泳，正式運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練前適應(yīng)性游泳1周，正式訓(xùn)練每周6天，休息一天，每天訓(xùn)練1次。第一周時(shí)從10min開(kāi)始，周末遞增至30min。第二至第六周每周遞增30min。

運(yùn)動(dòng)條件：水深50cm，水溫30℃±2℃。小鼠運(yùn)動(dòng)后，用干毛巾擦干，再用吹風(fēng)機(jī)輕吹，放回籠中休息。

2.4 取材時(shí)間

取樣時(shí)間為：第0周末即運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練前，完成一個(gè)定量運(yùn)動(dòng)負(fù)荷(10min)，分別在運(yùn)動(dòng)前安靜狀態(tài)、運(yùn)動(dòng)后即刻取小鼠血液。而且，于第2、4、6周末訓(xùn)練完成后，休息一天(實(shí)際小鼠運(yùn)動(dòng)后恢復(fù)48小時(shí))，次日完成同周相同定量運(yùn)動(dòng)負(fù)荷，分別在運(yùn)動(dòng)前安靜狀態(tài)、運(yùn)動(dòng)后即刻取小鼠血液。

2.5 試劑和儀器

本實(shí)驗(yàn)使用的流式細(xì)胞儀型號(hào)為美國(guó) BD公司 FACSCALIBUR，流式試劑均為BD生產(chǎn)。

Th1判別標(biāo)準(zhǔn)為：CD3+CD8-IFN-γ+；Th2判別標(biāo)準(zhǔn)為CD3+CD8-IL-4+

表2 流式抗體配色方案

2.6 實(shí)驗(yàn)流程

實(shí)驗(yàn)過(guò)程圖示如下：

3 結(jié)果與分析

3.1 Th1、Th2的流式分析圖

圖1 選定CD3+T細(xì)胞

圖4 Th2細(xì)胞(IL-4陽(yáng)性)

3.2 六周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)中Th1、Th2細(xì)胞數(shù)量變化

在6周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)中，運(yùn)動(dòng)前安靜組、運(yùn)動(dòng)后即刻組小鼠 Th1、Th2細(xì)胞陽(yáng)性百分比。

表3 各組Th1細(xì)胞的陽(yáng)性百分率

表 4 各組Th2細(xì)胞的陽(yáng)性百分率

3.2.1 六周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)中Th1、Th2細(xì)胞數(shù)量變化的應(yīng)答性特征

小鼠在6周遞增負(fù)荷的游泳訓(xùn)練中，0周、2周和4周Th1細(xì)胞的陽(yáng)性百分率A組均略低于J組，6周則A組均略高于J組(圖5)。這種變化無(wú)顯著性意義(P>0.05)。各周Th2細(xì)胞的陽(yáng)性百分率變化都是J組高于A組(見(jiàn)圖6)。這種變化在0周、2周和4周無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異，但6周的J組顯著高于A組(P<0.05)。

圖5 各周Th1細(xì)胞的應(yīng)答性變化

圖6 各周Th2細(xì)胞的應(yīng)答性變化

3.2.2 六周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)中Th1、Th2細(xì)胞數(shù)量變化適應(yīng)性特征

圖7 A組Th1、Th2細(xì)胞的適應(yīng)性變化

圖8 J組Th1、Th2細(xì)胞的應(yīng)答性變化

Th1細(xì)胞數(shù)量變化的適應(yīng)性特征表現(xiàn)為：1)和0周相比，安靜組Th1細(xì)胞數(shù)量2周、4周均明顯下降(P<0.05)，6周基本恢復(fù)。2) 和0周相比，即刻組Th1細(xì)胞數(shù)量也是先下降后恢復(fù)。2周、4周均明顯下降(P<0.05)，6周基本恢復(fù)。Th1細(xì)胞數(shù)量在第2周下降最為明顯，在J組和A組都是如此。

Th2細(xì)胞數(shù)量變化的適應(yīng)性特征表現(xiàn)為：1 )0周相比，2周、4周和6周J組和A組 Th2細(xì)胞數(shù)量均顯著上升(P<0.01)。2) J組2周、4周和6周之間Th2細(xì)胞數(shù)量變化不明顯(P>0.05)。A組2周、4周和6周Th2細(xì)胞數(shù)量呈遞降的趨勢(shì)，4周和2周比，6周和4周比呈統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。但Th2細(xì)胞數(shù)量6周還顯著高于0周水平。

3.3 六周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)中Th1/Th2比值變化

在6周遞增負(fù)荷游泳運(yùn)動(dòng)中，A組、J組小鼠 Th1/Th2比值變化見(jiàn)表5。

表5 各組Th1/Th2之比

3.3.1 六周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)中Th1/Th2比值變化的應(yīng)答性特征

6周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)中，各周小鼠A組、J組相比，Th1/Th2比值A(chǔ)組均高于J組，且這種差異在第6周具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

圖9 Th1/Th2比值變化的應(yīng)答性特征

3.3.2 六周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)中Th1/Th2比值變化的適應(yīng)性特征

1)和0周相比，2周、4周和6周J組和A組 Th1/Th2比值極顯著降低(P<0.001)；

2)2周Th1/Th2比值下降最為明顯；

3)2周、4周和6周之間呈遞增趨勢(shì)，6周A組明顯高于2周A組(P<0.05)，但仍沒(méi)有恢復(fù)到0周水平。

4 討論與分析

在6周的遞增負(fù)荷游泳訓(xùn)練中，小鼠外周血Th1細(xì)胞百分比呈現(xiàn)先下降后逐步恢復(fù)的特點(diǎn)；Th2細(xì)胞百分比各周均極顯著上升； Th1/Th2比值在6周遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)過(guò)程中顯著降低。提示小鼠在本運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練周期中，免疫平衡被打破，Th1/Th2平衡向Th2漂移，細(xì)胞免疫功能下降，體液免疫功能增強(qiáng)。

運(yùn)動(dòng)前安靜組

運(yùn)動(dòng)后即刻組

從實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，各周Th1細(xì)胞數(shù)量變化特征表現(xiàn)為：A組和J組都表現(xiàn)為2周下降最為明顯，下降幅度約為40%。4周逐步恢復(fù)，6周基本恢復(fù)到0周水平。提示，運(yùn)動(dòng)應(yīng)激刺激負(fù)性調(diào)控Th1細(xì)胞的生成。從應(yīng)激反應(yīng)的時(shí)程上分析，可以理解為小鼠在2周時(shí)處于警戒反應(yīng)或抵抗階段，4周和6周并沒(méi)有隨運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的增加而維持于此階段，而是呈恢復(fù)趨勢(shì)。

Th2與Th1細(xì)胞的變化趨勢(shì)剛好相好，0周相比，2周、4周和6周J組和A組 Th2細(xì)胞數(shù)量均明顯上升，上升幅度在3倍以上(P<0.001)。J組2周、4周和6周之間Th2細(xì)胞數(shù)量變化不明顯，維持在一個(gè)相對(duì)平穩(wěn)的水平。A組2周、4周和6周則出現(xiàn)略呈下降趨勢(shì)。提示，運(yùn)動(dòng)應(yīng)激刺激正性調(diào)控Th2細(xì)胞的生成，六周的遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)過(guò)程中Th2細(xì)胞的生成一直大幅度升高維持于高位。

Th1/Th2比值在運(yùn)動(dòng)周期過(guò)程中均明顯下降(A組和J組均下降5倍以上，P<0.001)，2周、4周和6周呈逐漸略升的趨勢(shì)。Th1/Th2比值的變化特點(diǎn)提示在6周的運(yùn)動(dòng)周期中，小鼠細(xì)胞免疫功能受到抑制，體液免疫功能增強(qiáng)，免疫平衡向體液免疫漂移，機(jī)體處于免疫失衡狀態(tài)。這種失衡在2周時(shí)最為明顯，4周和6周向恢復(fù)的方向發(fā)展，說(shuō)明各周雖然均處于免疫失衡的狀態(tài)，但失衡的程度沒(méi)有隨宜運(yùn)動(dòng)負(fù)荷的增加而加深。

不論是何種應(yīng)激引起的Th 1 /Th2漂移，各種調(diào)節(jié)因素最后總是作用于Th0向Th 1 、Th2分化的環(huán)節(jié)。從目前的研究資料看，應(yīng)激狀態(tài)下Th 1 /Th2漂移與下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì) ( HPA) 軸和交感-腎上腺髓質(zhì)(SAM)軸的廣泛激活有關(guān)[10]。淋巴細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞均表達(dá)多種應(yīng)激反應(yīng)激素的受體，包括CRH、ACTH、可的松、去甲上腺素受體，因此可以推斷在應(yīng)激情況下，神經(jīng)內(nèi)分泌激素釋放可以改變免疫系統(tǒng)功能。

在討論體育運(yùn)動(dòng)與機(jī)體免疫功能關(guān)系的時(shí)候，一般都引用經(jīng)典的“開(kāi)窗戶理論”和“J形典線”[11]，認(rèn)為長(zhǎng)時(shí)間大強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)降低機(jī)體免疫力，適量運(yùn)動(dòng)能增強(qiáng)機(jī)體免疫力，降低上呼吸道感染的機(jī)率。但對(duì)于運(yùn)動(dòng)影響了機(jī)體的哪些免疫功能則沒(méi)有深入研究。機(jī)體的免疫系統(tǒng)是一個(gè)龐大且功能復(fù)雜的系統(tǒng)，各免疫成分和功能之間相互聯(lián)系，相互制約。特異性免疫和非特異性免疫共同構(gòu)成機(jī)體“免疫防御”、“免疫監(jiān)視”和“免疫隱定”的功能。不同的運(yùn)動(dòng)量和運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度動(dòng)對(duì)機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液產(chǎn)生了不同的影響。在本研究中，遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)中，主導(dǎo)細(xì)胞免疫的Th1數(shù)量下降，而主導(dǎo)體液免疫功能的Th2細(xì)胞呈上升趨勢(shì)，意味著機(jī)體細(xì)胞免疫功能下降而體液免疫功能不但沒(méi)有下降，而且呈亢進(jìn)狀態(tài)。

本研究提示，運(yùn)動(dòng)對(duì)機(jī)體的體液免疫和細(xì)胞免疫產(chǎn)生了不同的影響。在長(zhǎng)時(shí)程的遞增負(fù)荷運(yùn)動(dòng)過(guò)程中，主導(dǎo)細(xì)胞免疫功能的Th1數(shù)量下降，而主導(dǎo)體液免疫功能的Th2數(shù)量反而上升。這對(duì)研究運(yùn)動(dòng)與免疫的關(guān)系提出了新的方向與思路。深入研究體育運(yùn)動(dòng)對(duì)不同免疫功能的影響有利于理解運(yùn)動(dòng)和免疫的內(nèi)在聯(lián)系，為科學(xué)健身和合理解釋訓(xùn)練過(guò)程中的免疫現(xiàn)象提供理論依據(jù)。

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EffectofSix-WeeksIncrementalSwimmingExerciseonImmuneBalanceinMice
——Th1，Th2cellsareassessedbyFlowCytometry

XIE Dong-bei1，XU Kai-xing1，HAO Xuan-ming2

(1.Gannan Normal University,Ganzhou 341000，China; 2.South China Normal University,Guangzhou 510631，China)

Objection: This research is designed to explore the change of immune balance (Th1/Th2)of mice during six weeks incremental load exercise.Method:64 male 8-week old SPE grade KM mice are divided randomly into 8 groups. The experimental groups conduct incremental swimming exercise, once a day, and six days a week for 6 weeks. The blood is got respectively 0 weeks,2 weeks, 4 weeks and 6 weeks after exercise. Th1, Th2 cells are calculated by flowcytometry.Result: (1) The amount of Th1 cell droped after exercise, most obvious after 2 weeks, and take on recovery trend in the sixth week. (2) The amount of Th2 cell rise obviously after 2, 4 and 6weeks. (3)The Th1/Th2 of experimental groups rise obviously in comparision with control group. Conclusion:1.The number of Th1 cells declined and Th2 cells Raised in the six-week incremental swimming exercise.Th1/Th2 balance is broken and polarized to Th2. exercise immunity,

immunitybalance,incremental swimmingexercise, h1/Th2, mouse

2014-08-28

謝東北(1972-)，男，博士，副教授

研究方向：運(yùn)動(dòng)免疫和健康教育

江西省教育廳科技項(xiàng)目(項(xiàng)目編號(hào)：GJJ08390)

G804.32

A

1007-323X(2014)06-0076-05