吡格列酮對高脂血癥大鼠主動脈組織MMP-2、MMP-9表達的影響

劉春麗 商瑋 趙凌杰 姚茹冰 董曉蕾 沈思鈺 郭郡浩 趙智明 蔡輝

·論著·

吡格列酮對高脂血癥大鼠主動脈組織MMP-2、MMP-9表達的影響

劉春麗 商瑋 趙凌杰 姚茹冰 董曉蕾 沈思鈺 郭郡浩 趙智明 蔡輝

目的觀察吡格列酮對高脂血癥大鼠主動脈基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(MMP-9)表達的影響。方法26只雄性SD大鼠隨機分成普通飼料組(n=9)和高脂飼料組(n=17)，分籠飼養(yǎng)，12周后檢測空腹血脂水平，以確定高脂飼料組高脂血癥大鼠造模是否成功；再將成模大鼠隨機分成模型組(n=8)和吡格列酮組(n=9)。第13周起予吡格列酮組大鼠予吡格列酮混懸液連續(xù)灌胃4周，余2組用相應(yīng)量的蒸餾水灌胃4周，平行檢測2組大鼠血脂水平，免疫組化檢測主動脈MMP-2、MMP-9表達，并用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)分析染色結(jié)果。結(jié)果高脂飼料喂養(yǎng)12周大鼠總膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平較對照組明顯升高(P<0.05)，表明造模成功。吡格列酮組主動脈MMP-2、MMP-9表達水平較之模型組明顯降低(P<0.05)。結(jié)論吡格列酮能通過抑制主動脈MMP-2、MMP-9表達，有利于斑塊的穩(wěn)定性增加。

吡格列酮；高脂血癥；動脈粥樣硬化；基質(zhì)金屬蛋白酶-2；基質(zhì)金屬蛋白酶-9

動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是一種伴有脂代謝紊亂、內(nèi)皮損傷及炎性反應(yīng)的慢性動脈疾病，其過程主要包括脂紋形成，纖維斑塊、粥樣斑塊和復(fù)合樣變?；|(zhì)金屬蛋白酶類(matrix metalloroteinases，MMPs)表達增加被認為是導(dǎo)致急性冠脈綜合征的主要原因之一，基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、MMP-9是其中重要的組成部分，參與細胞外基質(zhì)形成，是反應(yīng)斑塊穩(wěn)定性的分子生物學(xué)指標之一。吡格列酮(pioglitazone，TZDs)是一種過氧化酶增殖物激活受體γ(peroxisome proliferator-activated receptor-γ，PPAR-γ)激動劑，能夠減輕胰島素抵抗程度，改善脂質(zhì)代謝水平，抑制血管炎癥反應(yīng)，在AS早期具有血管保護作用，有效阻止AS進展[1]。本文探討吡格列酮對AS血管中MMP-2，MMP-9表達的影響，闡明其對AS斑塊穩(wěn)定性的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 出生21 d Sprague Dawley(SD)雄性健康大鼠，體重55～68 g，由我院動物實驗中心提供[實驗動物使用許可證號SYXK(蘇)2003-0032]。

1.2 實驗藥品和試劑 三酰甘油(TG)、總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、LDL-C檢測試劑盒，購自南京建成生物工程研究所。鹽酸吡格列酮片(15 mg/片)由杭州中美華東制藥生產(chǎn)。兔抗大鼠多克隆抗體MMP-2、MMP-9購自武漢博士德生物技術(shù)有限公司。SP雙染試劑盒由福州邁新生物科技有限公司生產(chǎn)。蘇木素染色液購自南京建成公司。中性樹膠為福州邁新生物科技有限公司。多聚賴氨酸由福州邁新生物科技有限公司，用蒸餾水配制成10%多聚賴氨酸。HE染色試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展公司。二甲苯、甲醇、枸櫞酸三鈉等其他試劑，均為國產(chǎn)分析純。

1.3 實驗儀器 組織切片機，美國Reichert HistoSTAT；孵箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司，型號：THZ-312；烤箱，上海圣欣科學(xué)儀器有限公司，型號：101AS-3；冰箱，中國海爾，型號：BCD-258A/C；顯微鏡，日本Nikon，型號：E200；天平，德國賽多利斯型號：E200；耐高溫塑料染色架，福州邁新型號：RAK-2001；Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)。

1.4 實驗方法

1.4.1 高脂血癥大鼠模型的建立及分組：26只大鼠表隨機分為高脂飼料(n=17)和普通對照組(n=9)，高脂組給予高脂飼料(魚粉3%、豬油12%、雞蛋12%、膽固醇2%、膽酸鹽0.5%、甲基硫氧嘧啶0.2%和72.3%的基礎(chǔ)飼料)，普通對照組給予標準大鼠飼料，分別喂養(yǎng)12周后，通過眼眶靜脈叢取血，平行檢測血脂水平以建立高脂血癥大鼠模型。成模大鼠(n=17)隨機分成模型組(n=8)和吡格列酮組(n=9)，自實驗第13周起，吡格列酮組大鼠給予吡格列酮混懸液(按吡格列酮10 mg·kg-1·d-1的劑量溶于1.5 ml/100 g體重的蒸餾水中制成混懸液)，連續(xù)灌胃4周，對照組和模型組給予相應(yīng)量的蒸餾水灌胃，干預(yù)期間模型組和吡格列酮組繼續(xù)喂飼高脂飼料。進食量控制在15 g·100 g-1·d-1，早、中、晚三餐定時定量，對照組給予普通飼料，實驗第16周末，禁食24 h后，用20%氯胺酮，以1 ml·100 g-1·d-1體型劑量麻醉后，剪開胸腔，暴露心臟，左心室穿刺取血5 ml，室溫靜置1 h后，3 000 r/min離心5 min，分離血清，置-20℃冰箱保存，待測血脂指標；冰盤中分離大鼠主動脈，置液氮中保存，待行組織形態(tài)學(xué)和免疫組化檢測。

1.4.2 HE染色：主動脈HE染色由南京凱基生物科技發(fā)展有限公司完成。于大鼠主動脈弓與胸主動脈交界處取材，10%中性甲醛固定，石蠟包埋，水平橫切面制備石蠟切片(厚度4 μm)，HE染色風(fēng)干，中性樹膠封片，×200光鏡下觀察。

1.4.3 大鼠血脂測定：三酰甘油(TG)用TPO-PAP法，總膽固醇(TC)用CHOD-PAP法，高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)和低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)用選擇性沉淀法。

1.4.4 大鼠主動脈MMP-2、MMP-9表達：采用SP法，胸主動脈根部取材至10%甲醛中固定，常規(guī)石蠟包埋，連續(xù)4 μm切片。二甲苯脫蠟，梯度酒精脫水后，不同濃度乙醇水化，PBS浸泡并清洗數(shù)次后。將放有切片的耐高溫塑料染色架放入盛有抗原修復(fù)緩沖液中，20 min后取出，自然冷卻。PBS浸泡、清洗，3% H2O2-甲醇溶液處理，再次PBS浸泡、清洗后加入一抗100 μl，放至37℃濕盒孵育2 h。相關(guān)處理后，加入HRP標記二抗50 μl。新鮮配制的二氨基聯(lián)苯氨(DAB)液進行顯色，鏡下觀察染色深淺，染好立即中止，用自來水輕柔沖洗15 min用蒸餾水終止顯色反應(yīng)。蘇木素復(fù)染，中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下進行結(jié)果觀察。

2 結(jié)果

2.1 實驗16周末3組大鼠主動脈組織形態(tài)學(xué)觀察 對照組血管壁三層結(jié)構(gòu)清晰，血管內(nèi)膜光滑，內(nèi)皮細胞完整，內(nèi)膜下可見少量泡沫細胞，中膜厚度均一，中膜平滑肌細胞與彈力板近似平行相間排列；模型組血管內(nèi)皮連續(xù)性受損，管壁局部向管腔突出，內(nèi)皮下大量脂質(zhì)和泡沫細胞堆積，部分內(nèi)膜增厚，中層結(jié)構(gòu)紊亂，平滑肌細胞明顯增生，排列紊亂；吡格列酮組內(nèi)膜未見明顯改變，內(nèi)皮細胞偶有脫落，內(nèi)膜下分布少量泡沫細胞，內(nèi)皮細胞尚完整，中膜厚度適中，平滑肌細胞輕度增生，分布較均勻，形態(tài)基本正常。見圖1。

圖1 3組大鼠主動脈組織形態(tài)學(xué)觀察(HE×200)

2.2 實驗12周末血脂、血糖水平 高脂飼料組TC、TG、LDL-C水平顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，參照文獻[2]，高脂飼料組17只大鼠均符合高脂血癥模型。見表1。

組別BGTGTCHDL?CLDL?C對照組(n=9)3．50±0．670．93±0．151．83±0．231．26±0．090．19±0．05高脂飲食組(n=17)3．54±0．841．73±0．47?2．98±0．32?1．36±0．200．50±0．34? t值-0．148-6．407-9．608-1．763-3．633 P值0．884<0．01<0．010．0910．002

注：與對照組比較，*P<0.01

2.3 實驗第16周末血脂、血糖水平 3組大鼠TG、TC1)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，因方差齊性，經(jīng)LSD兩兩比較后，模型組TC、TG、LDL-C較對照組水平顯著升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，吡格列酮組TC、TG水平較模型組明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)，3組間HDL-C、LDL-C、BG差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

組別BGTGTCHDL?CLDL?C對照組(n=9)3．42±1．400．80±0．191．69±0．321．19±0．150．15±0．05模型組(n=8)3．75±1．211．53±0．17?3．08±0．98?1．17±0．060．21±0．12吡格列酮組(n=9)3．48±1．290．73±0．32#1．72±0．25#1．20±0．210．23±0．08 F值0．15228．60014．9910．1242．073 P值>0．01<0．01<0．01>0．01>0．01

注：與對照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.4 3組大鼠主動脈MMP-2、MMP-9免疫組化染色 MMP-2、MMP-9表達陽性主要表現(xiàn)為細胞胞質(zhì)中有棕黃色顆粒狀陽性反應(yīng)物。實驗發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠主動脈MMP-2、MMP-9棕色顆粒狀陽性反應(yīng)物明顯增加，吡格列酮組大鼠主動脈MMP-2、MMP-9蛋白棕色顆粒狀陽性反應(yīng)物明顯減少。見圖2、3。

圖2 3組大鼠主動脈MMP-2(免疫組化×400)

圖3 3組大鼠主動脈MMP-9(免疫組化×400)

2.5 Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)對主動脈平均光密度值定量分析 結(jié)果顯示模型組的MMP-2、MMP-9陽性顆粒平均光密度明顯高于對照組(P<0.05)，吡格列酮組的平均光密度值顯著低于模型組(P<0.05)，而與對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

組別MMP?9MMP?2普通組0．156±0．0110．138±0．008模型組0．766±0．052?0．376±0．154?吡格列酮組0．166±0．005#0．154±0．011#

注：與對照組比較，*P<0.05； 與模型組比較，#P<0.05

3 討論

AS斑塊是否穩(wěn)定主要取決于斑塊性質(zhì)而非其大小，成熟斑塊由脂質(zhì)核心及纖維帽組成，生理狀態(tài)下膠原處在合成及分解的動態(tài)平衡之中，但在不穩(wěn)定斑塊中，這種平衡被打破，任何使膠原合成減少或降解增加的因素都可使纖維帽變薄而易于破裂[3]。動脈粥樣硬化(AS)斑塊形成過程中始終存在著細胞外基質(zhì)重構(gòu)，生成的細胞外基質(zhì)(ECM)和血管平滑肌細胞一起共同組成AS斑塊纖維帽。MMPs在AS血管壁胞外基質(zhì)重構(gòu)中發(fā)揮重要作用，是降解ECM的重要酶類。MMP-2是由血管壁細胞表達和分泌的，是最重要的MMPs之一，具有多種降解活性，能夠完整降解Ⅳ型基底膜膠原，Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ型膠原與變性的Ⅰ、Ⅲ型膠原及彈性蛋白[4]。外周血中的單核細胞與內(nèi)皮細胞黏附，在管壁中遷移以及吞噬脂質(zhì)演變?yōu)榕菽毎^程中，均可分泌MMP-2[5]?；罨腗MP-2幾乎可降解除多糖以外的全部胞外基質(zhì)，在動脈粥樣硬化的血管細胞中MMP-2表達的增加、活性的增強，降解斑塊的細胞外基質(zhì)成分而減弱斑塊強度，促進AS發(fā)生、發(fā)展，降低斑塊穩(wěn)定性。MMP-9是由中性粒細胞、巨噬細胞在受到特定刺激后合成分泌，降解人粥樣硬化斑塊纖維帽中的膠原蛋白。病理研究顯示人冠狀動脈粥樣硬化斑塊中MMP-9過度表達，斑塊不穩(wěn)定性明顯增加，并與急性冠脈綜合征病情嚴重程度相一致[6]。

吡格列酮作為PPARγ激動劑，通過PPAR-γ的特殊配體發(fā)揮改善胰島素抵抗及抑制血管炎性反應(yīng)等作用[7，8]。本實驗通過利用吡格列酮干預(yù)高脂血癥大鼠，觀察其對大鼠主動脈MMP-2、MMP-9表達的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)高脂血癥組大鼠主動脈MMP-2、MMP-9表達較對照組明顯增加，而吡格列酮組大鼠主動脈MMP-2、MMP-9表達較高脂血癥組大鼠明顯降低，表明吡格列酮能夠抑制主動脈MMP-2、MMP-9活性水平，減少斑塊內(nèi)ECM降解，防止斑塊破裂?？赡芘cCTGF、糖原合酶-3β(GSK-3β)抑制MMPs作用有關(guān)[9，10]，在增加斑塊穩(wěn)定性方面發(fā)揮重要作用，具體機制有待進一步研究。

綜上所述，吡格列酮能通過抑制MMP-2、MMP-9活性水平，抑制AS模型大鼠血管壁斑塊內(nèi)基質(zhì)降解程度，增加斑塊穩(wěn)定性，為進一步研究吡格列酮的抗AS理論提供更多的理論依據(jù)。

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EffectofpioglitazoneontheexpressionofMMP-2andMMP-9inaortaofratswithhyperlipidemia

LIUChunli,SHANGWei,ZHAOLingjie,etal.NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryCommand,Nanjing210002,China

ObjectiveTo observe the effect of pioglitazone on the expression of MMP-2 and MMP-9 in aorta of rats with hyperlipidemia.Methods26 male SD rats were randomly divided into normal diet control group (n=9) and high-fat diet group (n=16),and the rats were bred in respective cage.After 12 weeks,the fasting plasma lipid levels were detected to decide whether the animal models with hyperlipidemia in high fat diet group were successful or not.Then the model rats were redivided into model group (n=8) and pioglitazone group (n=9).From the 13th week,the rats in pioglitazone group were given pioglitazone (10mg·kg-1·d-1) by gavage for 4 weeks,however,the rats in the other two groups were given equivalent distilled water by gavage for 4 weeks,the blood fat levels in the two groups were detected,the expression levels of MMP-2 and MMP-9 in aorta were detected by immunohistochemisty,finally,the staining results were analyzed by Image Pro Plus 6.0 image analysis system.ResultsAfter 12-week feeding,the levels of total cholesterol (TC),triglyceride (TG) and low-density lipoprotein cholesterol (LDL-C) in high fat diet group were significantly increased,as compared with those in control group (P<0.05),which showed that the animal models were successfully established.The expression levels of MMP-2 and MMP-9 in aorta in pioglitazone group were significantly decreased,as compared with those in model group (P<0.05).ConclusionPioglitazone can inhibit the expression of MMP-2 and MMP-9 in aorta,accordingly increase plaque stability.

pioglitazone;hyperlipidemia; atherosclerosis;matrix metalloproteinases-2;matrix metalloproteinases-9

10.3969/j.issn.1002-7386.2014.05.006

210002 南京市，中國人民解放軍南京軍區(qū)南京總醫(yī)院中西醫(yī)結(jié)合科；

蔡輝，210002 中國人民解放軍南京軍區(qū)南京總醫(yī)院；

E-mail：caihuiphd@163.com

R 543.5

A

1002-7386(2014)05-0659-04

2013-12-11)