白芥子對(duì)蛇床子體外經(jīng)皮滲透的影響

李 洋，楊 丹，趙永偉，王艷宏

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱150040;2.南京海納醫(yī)藥科技有限公司，南京210009)

白芥子為十字花科植物白芥(Sinapis Alba L.)的干燥成熟種子，味辛，性溫，入肺經(jīng).具溫肺豁痰利氣，散結(jié)通絡(luò)止痛之功效[1].白芥子在外治法中常作為引赤發(fā)泡藥應(yīng)用.現(xiàn)代實(shí)驗(yàn)研究表明白芥子具有成為透皮吸收促進(jìn)劑的潛質(zhì)[2－6]，但其發(fā)揮促透皮作用的物質(zhì)基礎(chǔ)不是很清楚.蛇床子為傘形科植物蛇床Cnidium monnieri(L.)Cuss.的干燥成熟果實(shí)，具有溫腎壯陽(yáng)、祛風(fēng)、燥濕及殺蟲之效，主治陽(yáng)痿、宮冷、寒濕滯下和婦人瘙癢等.本實(shí)驗(yàn)以蛇床子為研究對(duì)象，以氮酮、薄荷油和冰片為對(duì)照，試圖通過考察白芥子各類組分對(duì)蛇床子中蛇床子素體外經(jīng)皮滲透的影響，以探討白芥子促透皮作用的物質(zhì)基礎(chǔ).

1 儀器與材料

儀器:HC－188型透皮吸收實(shí)驗(yàn)儀(天津市正通科技有限公司);2695型高效液相色譜儀，2996UV型檢測(cè)器，Empower工作站(美國(guó) Waters公司);超聲波清洗儀(無錫市超聲電子設(shè)備廠);電子恒溫水浴鍋(蘇州威爾實(shí)驗(yàn)用品有限公司).

實(shí)驗(yàn)動(dòng)物:Wistar大鼠，體重(180～220)g，合格證號(hào)為P00102004，由黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供.

2 試劑與藥品

白芥子(購(gòu)自哈藥集團(tuán)世一堂中藥飲片有限責(zé)任公司，經(jīng)鑒定符合《中國(guó)藥典》(2010年版)規(guī)定);蛇床子素對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào):201004);抗壞血酸(廣東汕頭新寧化工廠);無水乙醚(天津市北方天醫(yī)化學(xué)試劑廠);硫氰酸鉀(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);乙酸乙酯(天津富宇精細(xì)化工)甲醇(美國(guó)迪馬公司);0.9%氯化鈉注射液(黑龍江省哈爾濱市三聯(lián)藥業(yè)有限公司);活性炭(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);卡波姆971(美國(guó)Lubrizol公司);三乙醇胺(天津市化學(xué)試劑六廠);無水乙醇(天津市化學(xué)試劑六廠);冰片(廣州基元化工有限公司);薄荷油(鄭州中天實(shí)驗(yàn)儀器有限公司);脂溶性氮酮(天津市博迪化工有限公司);甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純.

3 方法與結(jié)果

3.1 白芥子各類成分的制備

采用水蒸氣蒸餾法、多級(jí)溶劑萃取法和水提醇沉法等聯(lián)合應(yīng)用，建立白芥子各類化學(xué)組分的拆分方法，將白芥子的化學(xué)成分拆分為:揮發(fā)油、脂肪油、芥子苷和黃酮、白芥子堿和芥子多糖5個(gè)組分.

將白芥子置5倍量pH值為5的濃度為0.5 mmol/L的抗壞血酸溶液中，于50℃恒溫水解3 h，再加4倍量水蒸汽蒸餾得到白芥子揮發(fā)油[7]，即芥子油.殘?jiān)舆m量乙醚于50℃索氏提取，40℃揮干乙醚得到白芥子脂肪油.

將白芥子用乙醚脫脂至完全，殘?jiān)?5%乙醇提取，重復(fù)提取兩次，合并濾液，將濾液濃縮成糖漿狀濃縮液，用蒸餾水稀釋，加入20%KSCN溶液，乙酸乙酯萃取，水溶液置4℃冰箱，48 h后析出得到芥子堿硫氰酸鹽結(jié)晶.回收乙酸乙酯液得到白芥子苷和黃酮[8].

取脫脂后的白芥子加25倍量水提取2次，每次2 h，濃縮后加5倍量95%乙醇醇沉后干燥得到白芥子多糖[9].

3.2 蛇床子凝膠的制備

取適量蛇床子，粉碎，加入10倍量95%乙醇回流提取2 h，殘?jiān)貜?fù)提取2次.合并提取液，減壓濃縮回收乙醇，在樣品液中加入1.25%的活性炭脫色，抽濾，70℃干燥至恒重，蛇床子提取物.

精密稱取卡波姆971基質(zhì)0.2 g均勻撒于4 mL水中，攪拌均勻，靜置12 h使充分溶脹，緩慢滴加三乙醇胺，邊加邊攪拌，調(diào)節(jié)pH值至6.5～7，將蛇床子提取物用適量蒸餾水溶解，加入無水乙醇3 mL，加入不同量促滲劑，加水至10 g，將上述組分混合均勻，即得半固體膠狀凝膠[10].

3.3 蛇床子中蛇床子素HPLC分析方法的建立

3.3.1 液相色譜條件

色譜柱 Kromasil C18(5 μm，250 mm × 4.6 mm);流動(dòng)相:甲醇－水(75∶25);柱溫:28℃;流速:1 mL/min;測(cè)定波長(zhǎng):322 nm.色譜圖見圖1、2.

圖1 蛇床子素對(duì)照品

3.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取蛇床子素對(duì)照品適量，置25mL量瓶中，用甲醇制成每1 mL含40 μg的對(duì)照品溶液.分別精密吸取此對(duì)照品溶液 0.1、0.5、1、1.5、2、2.5 mL，置5 mL量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜過濾.依次精密吸取以上續(xù)濾液各20 μL，按上述色譜條件注入高效液相色譜儀，測(cè)定峰面積.以質(zhì)量濃度(C)為橫坐標(biāo)，峰面積(A)為縱坐標(biāo)，得蛇床子素線性回歸方程為:A=329 99C －4 632.7，R2=0.999 4，表明蛇床子素在0.016 ～0.4 μg/mL 的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系.

圖2 蛇床子樣品

3.3.3 精確度試驗(yàn)

精密吸取蛇床子樣品溶液20 μL，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積，求得RSD值為1.45%(n=6)，表明本方法精密度良好.

3.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

精密吸取蛇床子樣品溶液20 μL，分別在0、3、6、12、18、24 h不同時(shí)間測(cè)定峰面積，求得 RSD 為0.66%(n=5)，表明該溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好.

3.4 離體鼠皮的制備

選取體重在(200±20)g的 Wistar大鼠，處死后剪毛，剝離背部皮膚并除去皮下脂肪，剪出適當(dāng)?shù)拇笮?，用生理鹽水浸泡并洗凈，再置于生理鹽水中冷藏保存，3 d內(nèi)使用.注意在每次實(shí)驗(yàn)前，仔細(xì)檢查以確定鼠皮的完整性，沒有任何破損.

3.5 離體滲透試驗(yàn)

采用改良Franz擴(kuò)散池，在擴(kuò)散池的供應(yīng)室和接受室之間將制好的鼠皮固定(鼠皮的角質(zhì)層朝向供應(yīng)室)，并將蛇床子凝膠1 g均勻涂抹在鼠皮表面.以30%乙醇生理鹽水液為接受液，水浴溫度為(37.0 ±0.5)℃，攪拌子的轉(zhuǎn)速為 200 r/min.分別于2、4、6、8、10、12 h 從接受室吸取 1 mL 樣品液，并補(bǔ)充等體積新鮮接受液.樣品液過0.45 μm微孔濾膜，精密吸取續(xù)濾液20 μL，按上述色譜條件測(cè)定接受液中蛇床子素的含量.按下式計(jì)算累積滲透量 Qn(μg·cm－2).

其中:Cn為第n個(gè)取樣點(diǎn)測(cè)得的藥物質(zhì)量濃度(μg/mL);Ci為第i個(gè)取樣點(diǎn)測(cè)得的藥物質(zhì)量濃度(μg/mL);V為擴(kuò)散池接受室的體積(mL);A為滲透面積(cm2);Vi為取樣體積(mL);做出以滲透曲線直線部分的累積滲透量∑Q(μg·cm－2)對(duì)滲透時(shí)間t的線性回歸方程，該Q－t方程的斜率即為透皮速率常數(shù) K(μg·cm－2·h－1).

3.6 白芥子各類成分及不同促進(jìn)劑對(duì)蛇床子素凝膠經(jīng)皮滲透的影響

3.6.1 白芥子各類成分的促透作用

分別制備含5%白芥子堿、5%白芥子苷和黃酮、5%白芥子多糖、5%白芥子脂肪油和0.3%白芥子揮發(fā)油的蛇床子凝膠，按相同條件進(jìn)行離體經(jīng)皮滲透試驗(yàn)，所得結(jié)果見表1.

表1 白芥子各類組分對(duì)蛇床子中蛇床子素經(jīng)皮滲透的影響

由表1實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知12 h的滲透速率大小依次為:0.3% 揮發(fā)油(14.588 0 μg·cm－2·h－1)＞5%苷和黃酮(8.483 μg·cm－2·h－1)＞5% 多糖(7.624 μg·cm－2·h－1) ＞ 5%白芥子堿(7.2950 μg·cm－2·h－1)＞ 空白對(duì)照(7.733 6 μg·cm－2·h－1)＞5%脂肪油(6.999 4 μg·cm－2·h－1).其中，白芥子揮發(fā)油對(duì)蛇床子中蛇床子素具有一定的促透皮作用，增滲透倍數(shù)為1.88.

3.6.2 白芥子揮發(fā)油的最佳促透質(zhì)量濃度及與不同促滲劑比較

分別制備了含 0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%白芥子揮發(fā)油，及含5%氮酮、5%薄荷油和5%冰片的蛇床子凝膠，按相同條件進(jìn)行離體經(jīng)皮滲透試驗(yàn)，所得結(jié)果見表2.

由表2實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，白芥子揮發(fā)油各質(zhì)量濃度均能明顯促進(jìn)蛇床子中蛇床子素的經(jīng)皮滲透，且在百分含量為0.5%時(shí)促透效果最佳.5%氮酮、5%薄荷油和5%冰片對(duì)蛇床子中蛇床子素的經(jīng)皮滲透也具有促進(jìn)作用，且滲透速率大小依次為:5%薄荷油(17.842 9 μg·cm－2·h－1)＞ 5% 冰片(17.004 2 μg·cm－2·h－1)＞ 5% 氮酮(16.656 0 μg·cm－2·h－1)＞0.5%白芥子揮發(fā)油(16.610 1 μg·cm－2·h－1)，增滲透倍數(shù)分別為:2.31、2.21、2.19 和 2.10.

表2 白芥子揮發(fā)油及不同促滲劑對(duì)蛇床子中蛇床子素經(jīng)皮滲透的影響

4 討論

4.1 透皮吸收促進(jìn)劑的百分含量選擇

透皮吸收促進(jìn)劑的應(yīng)用百分含量一般為1%～9%，其中以5%較為常用，因此本實(shí)驗(yàn)制備5%百分含量白芥子各類組分的凝膠劑進(jìn)行篩選實(shí)驗(yàn).但白芥子揮發(fā)油由于具有刺激性，本課題組前期試驗(yàn)研究表明其安全使用百分含量為0.5%，故選擇0.5%以下的一系列百分含量進(jìn)行透皮實(shí)驗(yàn).

4.2 接受液的選擇

蛇床子素的理化性質(zhì)為不溶于水和冷石油醚，溶于堿水、丙酮、甲醇、乙醇、三氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯，可溶于沸騰的石油醚.故而本實(shí)驗(yàn)預(yù)實(shí)驗(yàn)以含不同百分比的乙醇的生理鹽水液為接受液進(jìn)行考察，結(jié)果30%乙醇－生理鹽水溶液作為接受液效果最好，因此本實(shí)驗(yàn)采用30%乙醇－生理鹽水溶液為接受液.

4.3 白芥子促進(jìn)透皮吸收的物質(zhì)基礎(chǔ)為揮發(fā)油

白芥子中白芥子揮發(fā)油促透性最好，且在百分含量為0.5%時(shí)效果最佳.白芥子揮發(fā)油和其他促透劑都能促進(jìn)蛇床子素的經(jīng)皮吸收，其滲透速率大小依次為:5%薄荷油＞5%冰片＞5%氮酮＞0.5%白芥子揮發(fā)油.白芥子為中藥引赤發(fā)泡藥，其促滲機(jī)制可能是可逆地引起細(xì)胞膜蛋白質(zhì)的構(gòu)型變化，影響皮膚角質(zhì)層結(jié)構(gòu)，從而使皮膚的滲透性增強(qiáng).

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