心肝同治法及其組方對(duì)大鼠缺血心肌梗死面積及新生血管因子表達(dá)的影響

林 華 蔡智剛 唐新征

（深圳市福田區(qū)中醫(yī)院·518034）

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病在中醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中屬“胸痹心痛”范圍，作者認(rèn)為心肝同治法能明顯改善心臟缺血，是與促血管新生因子密切不可分，故促進(jìn)血管生成為中醫(yī)藥防治冠心病的可能機(jī)制之一。故擬定心肝同治組方，用于治療缺血性心臟病，可以顯著改善患者的心痛癥狀。本研究旨在探討心肝同治組方對(duì)急性心肌缺血大鼠心肌梗死面積、缺氧誘導(dǎo)因子1α（HIF-1α）以及血管生成素-1（Ang-1）、血管生成素-2（Ang-2）表達(dá)的影響，為該方的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物

選用雌性Wistar 大鼠60 只，體質(zhì)量220～260g，由廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

1.2 藥品

心肝同治法的基本處方組成：白參10g，柴胡10g，姜黃15g，熊膽0.1g，九香蟲(chóng)5g，白芥子3g，白芍15g；制劑：人參、熊膽、九香蟲(chóng)粉碎成細(xì)粉，混勻；姜黃、柴胡、白芥子、白芍等五味加水煎煮2 次，每次1.5 小時(shí)，合并煎液，濾過(guò)，濾液濃縮至相對(duì)密度為1.23-1.43 的稠膏，真空干燥，粉碎成細(xì)粉，加入上述細(xì)粉，混勻，備用。

1.3 儀器及試劑

HIF-1α 定量試劑盒、Ang-1/Ang-2 定量試劑盒，熒光定量PCR 檢測(cè)系統(tǒng)；紫外分光光度計(jì)；ST-2 轉(zhuǎn)膜儀和MV-3 電泳儀；圖像分析系統(tǒng)。

2 方法

2.1 急性心肌梗塞（AMI）模型的建立及分組方法

根據(jù)文獻(xiàn)操作，具體參見(jiàn)文獻(xiàn)[1]。

2.2 實(shí)驗(yàn)分組及給藥

實(shí)驗(yàn)分5 組,每組各12 只，假手術(shù)組僅行冠脈穿線而不結(jié)扎。將60 只造模成功大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為：模型組12只,造模后灌胃生理鹽水10mL/(kg·d)；高劑量中藥組12只,造模后灌胃中藥0.99g/(kg·d),相當(dāng)于成人臨床用藥等效劑量的2 倍；中藥低劑量組12 只,造模后灌胃中藥0.495g/(kg·d),相當(dāng)于成人臨床用藥等效劑量；倍他樂(lè)克組12 只,造模后每日灌胃倍他樂(lè)克10mg/(kg·d)。各治療組均于造模后24h 進(jìn)行相應(yīng)藥物干預(yù)1 次/d,灌胃持續(xù)12d。

2.3 樣本的取得、分離與制備

每組大鼠灌胃12d 后取9 只大鼠麻醉后剪開(kāi)胸腹腔,分離心臟,在心肌壞死組織周邊區(qū)剪取心肌約100mg,速放凍存管內(nèi),置液氮中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 觀察指標(biāo)及方法

2.4.1 心肌梗死范圍測(cè)定 參考文獻(xiàn)[1]，將大鼠梗死心肌組織與未梗死心肌組織分別稱重，以梗死心肌占左心室肌重量的百分比表示梗死范圍。

2.4.2 實(shí)時(shí)PCR 法檢測(cè)心肌HIF-1αmRNA 表達(dá) 樣品總RNA的提取及純化按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。

2.4.3 免疫組織化學(xué)測(cè)定Ang-1/Ang-2 蛋白表達(dá) 嚴(yán)格按照試劑盒要求進(jìn)行。

3 結(jié)果

3.1 心肌梗死范圍

表1顯示，假手術(shù)組大鼠無(wú)心肌梗死。各治療組梗死范圍均明顯小于模型組(P ＜0.05)，心肝同治高低劑量組明顯優(yōu)于消心痛組(P ＜0.05)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 心肝胃同治方對(duì)梗死范圍的影響

3.2 對(duì)缺血心肌HIF-1αmRNA 表達(dá)的影響

表2顯示，模型組HIF-1αmRNA 表達(dá)較假手術(shù)組增強(qiáng)(P＜0.05)；與模型組比較,倍他樂(lè)克組及高、低劑量中藥組的HIF-1αmRNA 表達(dá)明顯增加(P＜0.01),且高劑量中藥組表達(dá)明顯高于低劑量中藥組(P＜0.05)。高劑量中藥組HIF-1αmRNA表達(dá)與倍他樂(lè)克組相當(dāng),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.062)。

表2 大鼠缺血心肌HIF-1αmRNA 的表達(dá)

3.3 大鼠缺血心肌Ang-1/Ang-2 蛋白表達(dá)的影響

模型組、心肝同治組方組及倍他樂(lè)克組的Ang-1/Ang-2蛋白表達(dá)在大鼠缺血心肌組織中較假手術(shù)組明顯增高。心肝同治組方組及倍他樂(lè)克組的Ang-1 蛋白表達(dá)較模型組明顯增高，而Ang-2 蛋白表達(dá)較模型組明顯降低，心肝同治低劑量組與倍他樂(lè)克組兩組間比較無(wú)明顯差異；心肝同治高劑量組與倍他樂(lè)克組兩組間比較有明顯差異。

表1 大鼠缺血心肌Ang-1 蛋白的表達(dá)

表2 大鼠缺血心肌Ang-2 蛋白的表達(dá)

4 討論

缺血心肌側(cè)支循環(huán)建立的主要方式為微血管生成，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）的表達(dá)受多種因子的調(diào)控,其中缺血或缺氧是誘導(dǎo)VEGF 表達(dá)的最主要因素[2],缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）是VEGF 的轉(zhuǎn)錄活化因子[3],主要由HIF-1α 和HIF-1β 兩個(gè)亞單位組成。激活的HIF-1 促使VEGF 和VEGF 受體表達(dá)增加,刺激缺氧組織建立有效的側(cè)支循環(huán)并恢復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞的完整性,發(fā)揮自身搭橋作用,誘導(dǎo)新生血管形成[4～6]。

近年，國(guó)外研究提出“血管新生平衡學(xué)說(shuō)”，即在正常的情況下，血管新生的誘導(dǎo)因子與抑制因子處于一種動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，一旦微環(huán)境改變，此平衡被打破，就會(huì)激活誘導(dǎo)因子來(lái)促血管新生或抑制因子促血管退化。因此，可以說(shuō)這兩類因子的平衡狀態(tài)決定了血管是否生長(zhǎng)的狀態(tài)。其中Ang-1和Ang-2 是最有效的血管新生調(diào)節(jié)因子[7]。Ang-2 通過(guò)結(jié)合Tie2 競(jìng)爭(zhēng)性抑制Ang-1 的促Tie2 磷酸化作用，以破壞血管的穩(wěn)定性，通過(guò)增加VEGF 的血管生成作用來(lái)促進(jìn)腫瘤的生長(zhǎng)，而Ang-1 作用與之相反[8]。研究表明Ang-1 有促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞生芽、遷移、趨化和聚集，從而形成原始管狀結(jié)構(gòu)及維持并穩(wěn)定血管的作用。而Ang-2 主要通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制Ang-1 形成不穩(wěn)定滲漏性血管。因此Ang-1 與Ang-2 的平衡關(guān)系，決定著血管穩(wěn)定或生長(zhǎng)狀態(tài)[9～11]。

冠心病心絞痛，中醫(yī)稱“胸痹（心痛）”，現(xiàn)已達(dá)成共識(shí)認(rèn)為本病乃心氣虧虛，心絡(luò)與心肌失養(yǎng)，痰瘀互結(jié)，心絡(luò)不通的本虛標(biāo)實(shí)之證，其病位在心絡(luò)，累及心肌。釀生心氣虧虛、痰瘀互結(jié)之因，除與飲食失當(dāng)、寒邪內(nèi)侵、年老體虛等密切相關(guān)外，精神情志因素在本病的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起著重要作用，所謂“七情之由作心痛”（沈金鰲《雜病源流犀燭·胃病源流》），七情中尤以肝失疏泄，條達(dá)失司最為關(guān)鍵。若肝氣郁滯，疏泄無(wú)力，勢(shì)必加重心氣推動(dòng)之力，“勞則氣耗”，久之，則可致使心氣虧虛，即“肝氣滯則心氣乏”，故而“心病先求于肝，乃清其源也”（《明醫(yī)雜著·醫(yī)論》）。清·陳士鐸在《石室秘錄·雙治法》篇中亦極力倡導(dǎo)“心痛治肝”之法。

古文獻(xiàn)中有以疏肝理氣解郁立法治療類似胸痹心痛證候的有效名方，如《太平圣惠方》的金鈴子散、《圣劑總錄》中郁金飲、《類證治裁》中的清郁湯、《醫(yī)學(xué)心悟》的沉香降氣散等。但以古方為基礎(chǔ)，研制出體現(xiàn)疏肝理氣解郁或心肝同治特色治療冠心病心絞痛之專方卻非常薄弱，而深入到分子水平研究其治療機(jī)理者更少。故以古方為基礎(chǔ)，研制出體現(xiàn)理氣解郁治療冠心病心絞痛之專方卻是現(xiàn)代研究的薄弱環(huán)節(jié)。從肝治心組方由人參、柴胡、白芍、姜黃、熊膽等七味中藥組成，體現(xiàn)“從肝治心，心肝并調(diào)”之治療原則，肝能調(diào)氣機(jī)、暢血脈，周學(xué)?！蹲x醫(yī)隨筆》謂：“肝者，貫陰陽(yáng)，統(tǒng)氣血”，《素問(wèn)·六節(jié)臟象論》曰：“肝者，魂之居也”，“以生血?dú)狻?，我們認(rèn)為，這一中醫(yī)學(xué)理論可能是心肝同治法組方促血管新生的機(jī)制所在。

本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用冠狀動(dòng)脈結(jié)扎造成大鼠急性心肌缺血模型，觀察缺血心肌梗死范圍及HIF-1α、Ang-1/Ang-2 表達(dá)的變化。結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，心肝同治方具有明確縮減心梗面積、誘導(dǎo)HIF-1α 表達(dá)增多、促進(jìn)Ang-1 及抑制Ang-2 的表達(dá)，從實(shí)驗(yàn)角度驗(yàn)證了心肝同治理論的正確性,說(shuō)明該方具有促血管新生，從而達(dá)到增加心臟側(cè)支循環(huán)，保護(hù)心臟，延緩心肌缺血的作用。

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