基于全基因組的卷柏復(fù)蘇相關(guān)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子基因家族分析△

徐志超，浦香東，宋經(jīng)元

(中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 藥用植物研究所/國(guó)家中醫(yī)藥管理局 中藥資源保護(hù)重點(diǎn)研究室，北京 100193)

復(fù)蘇植物能夠在脫水95%以上的生理情況下生存且遇水復(fù)蘇，在蕨類(lèi)植物和苔蘚植物中常見(jiàn)，被子植物中數(shù)量極少[1-2]。復(fù)蘇植物極度耐旱的特點(diǎn)成為國(guó)際研究的熱點(diǎn)之一，被認(rèn)為是抗旱基因挖掘及利用的模式植物。截至目前多個(gè)復(fù)蘇植物的基因組已公布，如單子葉植物復(fù)活草Oropetiumthomaeum[3]、維柯薩Xerophytaviscosa[4]和雙子葉植物旋蒴苣苔Boeahygrometrica[5]，為抗旱基因的挖掘提供資源。

卷柏Selaginellatamariscina，又稱(chēng)“九死還魂草”，為石松綱卷柏科卷柏屬植物，旱時(shí)卷曲，遇水而榮，是典型的復(fù)蘇植物[6-7]。卷柏屬包括約700個(gè)種，《中國(guó)植物志》中記錄有66種卷柏[8]，2015版《中華人民共和國(guó)藥典》以卷柏和墊狀卷柏S.pulvinata入藥，其干燥全草炒炭后具有活血通經(jīng)的功能[9]。卷柏屬不同物種間遺傳分化極其顯著，其生理特點(diǎn)也顯著不同，如卷柏為耐旱型[10]，而江南卷柏為干旱敏感型[11]。

AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子在植物生長(zhǎng)發(fā)育、脅迫響應(yīng)中發(fā)揮重要的調(diào)控作用，包括干旱、高鹽、低溫等逆境脅迫響應(yīng)[12]。AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族至少含有一個(gè)高度保守的AP2結(jié)構(gòu)域，根據(jù)結(jié)構(gòu)域的數(shù)量和識(shí)別序列不同，分為AP2、ERF、RAV、DREB、SOLOIST等5個(gè)亞家族[13]。已報(bào)道多個(gè)基于全基因組分析AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族的研究，如擬南芥[14]、水稻[15]、葡萄[16]、丹參[17]等，然而低等植物AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子的挖掘研究較少。本研究基于課題組前期卷柏基因組的研究數(shù)據(jù)，挖掘卷柏的AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子，篩選與卷柏復(fù)蘇密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。

1 材料和方法

1.1 卷柏基因組、轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)

卷柏基因組組裝、注釋及轉(zhuǎn)錄組測(cè)序工作由本課題組完成。卷柏基因組測(cè)序原始數(shù)據(jù)(PacBio RSII測(cè)序平臺(tái))以及卷柏干旱及復(fù)水的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(Illumina HiSeq4000測(cè)序平臺(tái))已上傳至NCBI(National Center for Biotechnology Information)的SRA(Sequence Read Archive)數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)：SAMN07840812(BioSample ID)、PRJNA416064(BioProject ID)。

1.2 基于蛋白序列比對(duì)的卷柏AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子鑒定

下載擬南芥AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子的AP2、ERF、DREB、RAV、SOLOIST亞家族成員，采用BLASTP比對(duì)卷柏基因組蛋白序列，Evalue設(shè)置為1E-5；采用PFAM數(shù)據(jù)庫(kù)隱馬爾科夫模型HMM：PF00847搜索卷柏基因組數(shù)據(jù)庫(kù)，Evalue設(shè)置為1E-5。以gff文件格式從基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中提取所有AP2/ERF序列，根據(jù)NCBI網(wǎng)站BLASTP比對(duì)的結(jié)果，利用APOLLO軟件手動(dòng)校正序列。校正后，保存每個(gè)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子的CDS、DNA、蛋白序列信息。在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)PROSITE(http：//prosite.expasy.org/)中確認(rèn)每個(gè)成員的保守結(jié)構(gòu)域序列，用DNAMAN軟件比對(duì)分析其保守性。

1.3 AP2/ERF系統(tǒng)進(jìn)化、基因結(jié)構(gòu)和保守基序分析

將卷柏和擬南芥AP2/ERF家族成員的蛋白序列采用MUSCLE做多序列比對(duì)，構(gòu)建NJ(Neighbour-Joining)樹(shù)，選擇Jones-Taylor-Thornton(JTT)模型，重復(fù)次數(shù)1000次?；贑DS序列及對(duì)應(yīng)基因組序列，利用在線服務(wù)器Gene Structure Display Server(GSDS 2.0)(http：//gsds.cbi.pku.edu.cn/index.php)對(duì)基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。利用MEME(Suite version 4.9.1)(http：//meme-suite.org/)對(duì)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子保守基序進(jìn)行分析，具體原則如下：E值小于2×10-30，基序重復(fù)次數(shù)不限，氨基酸個(gè)數(shù)10～200個(gè)。

1.4 AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族基因的差異表達(dá)分析

本研究分析卷柏干旱及復(fù)水處理的9個(gè)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，分別為干旱(hydration，HD)、70%相對(duì)含水量(Relative water content，RWC)、50% RWC、30% RWC、15% RWC、5% RWC、復(fù)水2 h(rehydration,RH)、RH 4 h、RH 6 h?；谵D(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，通過(guò)HiSAT2和Cufflinks軟件計(jì)算AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子的FPKM值[18]。按公式(1)計(jì)算RWC。

(1)

式中：Fwt為干旱時(shí)間點(diǎn)的卷柏質(zhì)量；Dwt為卷柏在65 ℃烘干2 d后的質(zhì)量；FTwt為卷柏復(fù)水24 h后的質(zhì)量[11]。

2 結(jié)果和分析

2.1 卷柏AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族預(yù)測(cè)及系統(tǒng)進(jìn)化分析

在卷柏基因組中共預(yù)測(cè)到68個(gè)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子基因，基因數(shù)量遠(yuǎn)低于高等植物中AP2/ERF的基因數(shù)量，如擬南芥(147)、葡萄(132)、水稻(164)、丹參(170)。卷柏AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子的長(zhǎng)度范圍在72 aa(ST44G415)到587 aa(ST311G14)之間，其cDNA長(zhǎng)度在219 bp到1764 bp之間。

用卷柏和擬南芥AP2保守結(jié)構(gòu)域建進(jìn)化樹(shù)，AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子家族被分為5個(gè)亞家族，分別為AP2、DREB、ERF、RAV和SOLOIST，各亞家族成員個(gè)數(shù)分別為23、16、18、8和 3，如圖1所示。擬南芥、葡萄和丹參的SOLOIST基因只有一個(gè)，水稻中未發(fā)現(xiàn)SOLOIST基因，但卷柏中發(fā)現(xiàn)3個(gè)，認(rèn)為SOLOIST基因在進(jìn)化過(guò)程中發(fā)生基因數(shù)量的收縮。高等植物AP2、ERF、DREB的亞家族成員遠(yuǎn)遠(yuǎn)多于卷柏中，證明進(jìn)化過(guò)程中該亞家族存在巨大的基因擴(kuò)張。利用DNAMAN軟件對(duì)擬南芥和卷柏的DREB亞家族成員保守結(jié)構(gòu)域序列進(jìn)行比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)AP2/ERF保守結(jié)構(gòu)域(YRG和RAYD元件)在卷柏和擬南芥中高度保守，如圖2所示。

圖1 卷柏AP2/ERF基因家族系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.2 卷柏AP2/ERF基因家族的基因結(jié)構(gòu)分析

AP2/ERF基因家族的基因結(jié)構(gòu)顯示不同亞家族基因結(jié)構(gòu)差異較大，兩個(gè)RAV亞家族基因(ST294G02和ST311G14)所含內(nèi)含子數(shù)最多(14個(gè))，而大部分DREB、ERF亞家族成員不含內(nèi)含子，如圖3所示。AP2/ERF家族成員的保守基序顯示AP2/ERF各亞家族之間序列相對(duì)保守，亞家族內(nèi)部有一定差異。位于同一個(gè)亞家族內(nèi)含有相同基序的成員，可能具有相似功能。

2.3 AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子基因的差異表達(dá)分析

AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子的DREB亞家族是干旱應(yīng)答元件的結(jié)合蛋白，與植物干旱、高鹽等逆境密切相關(guān)。本研究對(duì)卷柏進(jìn)行干旱脅迫及復(fù)水處理，HD(hydration)、70% RWC、50% RWC、30% RWC、15% RWC、5% RWC、RH 2 h(rehydration)、RH 4 h、

圖2 卷柏AP2/ERF亞家族數(shù)量分布(A)及DREB亞家族AP2/ERF保守結(jié)構(gòu)域比對(duì)(B)

注：A.亞家族成員建樹(shù)；B.亞家族成員基因結(jié)構(gòu)；C.亞家族成員蛋白保守基序分布。圖3 卷柏DREB亞家族基因結(jié)構(gòu)特征和保守基序分布

RH 6 h處理的9個(gè)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(共100 G)比對(duì)到卷柏基因組，計(jì)算FPKM值，篩選AP2/ERF基因的表達(dá)譜，如圖4所示。FPKM值越大，說(shuō)明基因表達(dá)豐度越高，反之則說(shuō)明基因表達(dá)豐度越低。由于基因表達(dá)FPKM值差異顯著，將FPKM值用scale函數(shù)做Z-score標(biāo)準(zhǔn)化處理，顯示基因在不同處理下的表達(dá)差異并聚類(lèi)。從基因表達(dá)模式來(lái)看，HD、70% RWC和RH 6 h的AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子基因表達(dá)聚在一起，而干旱脅迫嚴(yán)重的50% RWC、30% RWC、15% RWC、5% RWC、RH 2 h(rehydration)、RH 4 h的基因表達(dá)聚為另一枝。ST429G11、ST44G415和ST565G040基因的表達(dá)聚在一起，響應(yīng)干旱脅迫最為敏感的一枝，其中ST429G11和ST44G415屬于DREB亞家族，ST565G040為ERF亞家族。

圖4 AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子在卷柏干旱脅迫及復(fù)水處理下的表達(dá)圖譜

47%的AP2/ERF基因家族成員在干旱脅迫及復(fù)水處理下顯示高表達(dá)(FPKM>10)，15%的AP2/ERF基因家族成員表達(dá)沉默(FPKM<1)，推測(cè)為沉默基因或假基因。17個(gè)基因與卷柏干旱及復(fù)水表型顯著正相關(guān)，呈共表達(dá)，在干旱脅迫后顯著高表達(dá)[log2(50%RWC/HD)>1]，且復(fù)水后基因表達(dá)降低，其中包括7個(gè)DREB亞家族、6個(gè)ERF亞家族和4個(gè)AP2家族成員，如圖5所示。推測(cè)在卷柏干旱脅迫后顯著高表達(dá)的AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子在卷柏生長(zhǎng)發(fā)育及脅迫響應(yīng)進(jìn)程中起重要的調(diào)控作用。

卷柏中表達(dá)最高的兩個(gè)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子成員均屬于DREB亞家族，分別為ST429G11和ST44G415，其FPKM值在5%RWC狀態(tài)下高達(dá)2833和3977，分別是HD狀態(tài)下的12倍和74倍。啟動(dòng)子結(jié)合元件顯示ST429G11的啟動(dòng)子序列含有AREB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的ABA響應(yīng)元件(ABRE，ACGTGG)、GRF7轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的GTE元件(TGTCAGG)和熱激元件(HSE，AAAAAATTAC)的結(jié)合位點(diǎn)；ST44G415的啟動(dòng)子序列含有 GRF7轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的GTE元件(TGTCAGG)的結(jié)合位點(diǎn)。研究推測(cè)ST429G11為ABA非依賴的調(diào)控途徑中響應(yīng)干旱脅迫的重要調(diào)控因子。

注：不同的線條顏色代表17個(gè)干旱脅迫相關(guān)的AP2/ERF編碼基因。圖5 候選參與卷柏干旱脅迫響應(yīng)的AP2/ERF基因共表達(dá)

3 討論

本研究基于卷柏全基因組測(cè)序，對(duì)其AP2/ERF家族成員進(jìn)行系統(tǒng)鑒定，篩選參與卷柏干旱脅迫進(jìn)程密切相關(guān)的AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子。研究發(fā)現(xiàn)卷柏DREB亞家族成員主要參與其非生物脅迫響應(yīng)進(jìn)程如干旱脅迫，與已報(bào)道的其他植物的DREB功能相一致。

在卷柏基因組中共鑒定到68個(gè)AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于其他高等植物AP2/ERF家族成員數(shù)量，與低等植物齒肋赤蘚Syntrichiacaninervis的數(shù)量(80)接近[19]，低等植物到高等植物AP2/ERF基因數(shù)量的擴(kuò)張反映了植物在進(jìn)化過(guò)程中響應(yīng)非生物脅迫和生物脅迫的轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控的重要性及復(fù)雜性。此外，通過(guò)多序列比對(duì)及保守基序分析發(fā)現(xiàn)，卷柏AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子的AP2/ERF結(jié)構(gòu)域與高等植物擬南芥AP2/ERF的存在差異，但核心保守結(jié)構(gòu)域一致，表明該轉(zhuǎn)錄因子在物種進(jìn)化中基因結(jié)構(gòu)具有較高的保守性。

DREB亞家族和ERF亞家族結(jié)構(gòu)相似，均具有一個(gè)AP2/ERF亞家族，且一般不含有內(nèi)含子，主要區(qū)別在于保守AP2結(jié)構(gòu)域的第14和19位氨基酸不同。兩個(gè)亞家族功能亦相似，在植物響應(yīng)生物及非生物脅迫時(shí)發(fā)揮重要的調(diào)控作用。在藥用植物領(lǐng)域，干旱、高鹽等非生物脅迫或生物脅迫顯著影響藥用植物品質(zhì)，AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控作用也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)，同樣主要來(lái)自于DREB和ERF亞家族成員的調(diào)控，如長(zhǎng)春花ERF亞家族成員ORCA3可以調(diào)控萜類(lèi)吲哚生物堿代謝途徑中的多個(gè)關(guān)鍵酶，影響長(zhǎng)春堿的產(chǎn)量[20]。本研究發(fā)現(xiàn)：卷柏的DREB和ERF亞家族系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系較近，聚在一大枝；卷柏的干旱脅迫響應(yīng)極為敏感的AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子基因絕大部分來(lái)自于DREB和ERF亞家族。從復(fù)蘇植物卷柏干旱響應(yīng)調(diào)控因子AP2/ERF成員的結(jié)構(gòu)保守性推測(cè)其在卷柏干旱脅迫進(jìn)程中的調(diào)控機(jī)制與高等植物相似，但仍需要進(jìn)一步的功能鑒定。卷柏AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子的挖掘?qū)⒇S富植物干旱響應(yīng)的基因資源庫(kù)，為卷柏復(fù)蘇分子機(jī)制的解析奠定基礎(chǔ)，同時(shí)有助于研究植物進(jìn)化過(guò)程中AP2/ERF轉(zhuǎn)錄因子的基因擴(kuò)張或功能分化。

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