響應(yīng)曲面法提取阿里紅中總?cè)扑岢煞?/h1>

2014-08-17 09:50:50張慧鋒郭淑英吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院吉林吉林132013

吉林醫(yī)藥學(xué)院學(xué)報訂閱 2014年6期 收藏

關(guān)鍵詞：工藝

張慧鋒，郭淑英，申 蕾，付 非 (吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院，吉林 吉林 132013)

阿里紅(FomesofficinalisAmes)，又名苦白蹄，屬于擔(dān)子菌綱(Basidiomycetes)、多孔菌目(Polyporales)、多孔菌科(Polyporaceace)、層孔菌屬(Fomes)[1]。新疆《維吾爾醫(yī)常用藥材》一書中稱阿里紅為“落葉松茸”，用維吾爾語音譯為“哈里坤”。阿里紅是我國新疆地區(qū)維吾爾民族醫(yī)生常用的治療藥物之一， 民間驗方也用以治病。從阿里紅中分離得到的化合物主要有三萜酸類、倍半萜類、多糖及直鏈烷烴等,其中三萜酸類的化合物含量最高。

目前，傳統(tǒng)的三萜酸類化合物的提取方法主要有水提法、醇回流提取、堿性水或稀醇提取與其他有機溶劑萃取的方法等等，以上方法[2]被廣泛應(yīng)用于三萜酸類化合物的提取，費時、費材料，不利于節(jié)約資源、經(jīng)濟生產(chǎn)。因此本研究不采用回流提取法，而是采用目前較常用、并可以用于工業(yè)生產(chǎn)的超聲提取法，研究阿里紅三萜酸類化合物的提取工藝。

響應(yīng)面設(shè)計法(Response Surface Methodology，RSM)是一種統(tǒng)計設(shè)計試驗技術(shù)的合成方法，將回歸方法用作函數(shù)估算的工具，利用試驗結(jié)果與多因子試驗中各個因子之間的相互關(guān)系，以及多項式中的近似因子之間的關(guān)系得到相應(yīng)的函數(shù)，再通過合理的試驗設(shè)計，盡量能以相對比較少的試驗項目、較短的試驗時間和最經(jīng)濟實用的試驗方式對整個實驗進行全面的研究，科學(xué)地分析整體和局部之間的關(guān)系，進而得到明顯的、有目的的結(jié)論[3]。

研究發(fā)現(xiàn)，三萜酸類化合物提取效果與提取溫度、時間、超聲波功率等有密切關(guān)系。本實驗在單因素實驗的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)曲面法中心組合設(shè)計，最終確定阿里紅中三萜酸類化合物提取的最佳工藝。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

阿里紅藥材購于新疆維吾爾醫(yī)醫(yī)院;

高氯酸、香草醛(天津市大茂化學(xué)試劑廠),乙醇(95%,天津市永大化學(xué)試劑開發(fā)中心),齊墩果酸的對照品(上海市融禾醫(yī)藥科技有限公司,批號080921),冰醋酸(北京化工廠)。

Rotavapor R-3旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(瑞士BUCHI),KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗儀(昆山超聲儀器有限公司),BSA623S-CW型電子天平[北京賽多利斯科學(xué)儀器(德國)有限公司],GZX-DH-50X55-S型電熱恒溫干燥箱(上海市躍進醫(yī)療機械廠),DK-98-1型數(shù)顯電子恒溫水浴鍋(天津泰斯特儀器有限公司),SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)式多用真空泵(鄭州亞榮儀器有限公司),1700紫外分光光度儀(日本島津)。

1.2 紫外分光光度法測定總?cè)扑岬暮?/h3>

1.2.1 確定顯色方法

根據(jù)相關(guān)文獻，高氯酸-香草醛比色法適用于各種三萜酸的顯色，因此，本實驗選用此法顯色，然后對樣品進行紫外檢測。

1.2.2 選擇檢測的波長

精密稱取齊墩果酸對照品5 mg置于25 mL容量瓶中，乙醇溶解并定容至刻度，就可以得到齊墩果酸的對照品溶液，溶液的濃度是0.2 mg/mL。

精密移取供試品與對照品溶液0.6 mL置20 mL帶塞的試管中，揮去溶劑，然后加入新配制5%香草醛-冰醋酸0.4 mL和高氯酸1.6 mL，置70 ℃恒溫水浴中加熱15 min，然后冷卻至室溫，再精密加入冰醋酸8.0 mL，搖勻，于400～800 nm范圍下掃描波長，從圖中得到最大吸收波長。

1.2.3 標準曲線的制備

將精密吸取的齊墩果酸對照品溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于試管中，用水浴將乙醇揮干，加入1.6 mL高氯酸，0.4 mL 5%香草醛-冰醋酸溶液，放置于70 ℃恒溫水浴中，加熱反應(yīng)15 min，然后冷卻至室溫，然后再分別加入8.0 mL冰醋酸溶液，用超聲將其混勻。以空白樣品為參照，使用紫外分光光度計，于波長547 nm處測得吸光度值。然后將齊墩果酸的質(zhì)量作為橫坐標，測得的吸光度值作為縱坐標，建立相應(yīng)的標準曲線。應(yīng)用最小二乘法做線性回歸，可以得到相應(yīng)的回歸方程。

1.2.4 樣品中總?cè)扑岷康臏y定

取在不同的條件下提取的阿里紅浸膏150 mg，然后用乙醇溶解，置于100 mL容量瓶中定容至刻度線。精密量取上述溶液0.5 mL，放置水浴中直至溶劑完全揮去，然后再分別加入0.4 mL 5%的香草醛-冰醋酸溶液，1.6 mL高氯酸并混勻，放置70 ℃的恒溫水浴中反應(yīng)15 min，冷卻至室溫，再加8 mL冰醋酸并混勻，用紫外分光光度法(Ultraviolet spectrophotometry，UV)于波長547 nm處測得吸光度值，然后代入1.2.3中得到的標準曲線中,并計算得到的三萜酸含量。

其中：C(mg/mL)—測定樣品液的濃度

V1(mL)—測定時稀釋的體積

V2(mL)—樣品溶液定容后的體積

V0(mL)—測定吸光度時所用的樣品液體積

W(mg)—原藥材質(zhì)量

1.3 方法學(xué)考察

1.3.1 精密度試驗與重復(fù)性試驗

按照1.2.4中應(yīng)用的方法，平行操作測試5組樣品，具有重復(fù)性的試驗可以用于評價測定方法，確定其可靠性，選取其中的一組平行地連續(xù)測定5次，然后進行精密度的考察，測定所得結(jié)果間接近的程度[2]。

1.3.2 穩(wěn)定性試驗

準確吸取供試品溶液一份，再分別按照1.2.4項的方法操作，在60 min內(nèi)每隔10 min測定相應(yīng)的吸光度值，考察顯色的穩(wěn)定性[2]。

1.3.3 加樣的回收率試驗

量取9份已知含量的供試品溶液，置于具塞的試管中，再分別加入對照品溶液，按1.2.4中的方法顯色并測定吸光度，最后計算其中三萜酸的含量，計算得平均回收率。回收率試驗一般用于評價測定方法的準確性[2]。

1.4 優(yōu)化超聲波提取工藝

考慮不同的因素對三萜酸提取率的影響，三萜酸類化合物提取效果主要與提取溫度、時間、超聲功率有密切關(guān)系，因此本研究對超聲時間、超聲溫度、超聲功率進行了單因素試驗，然后利用響應(yīng)曲面法確定最佳提取條件。

1.4.1 單因素實驗

超聲波提取的影響因素比較多，在進行預(yù)實驗時，考察了超聲功率、提取時間、提取溫度對提取率的影響，發(fā)現(xiàn)對結(jié)果影響較大。所以在實驗中，超聲功率、提取時間和提取溫度將作為考察因素。超聲提取的溫度分別設(shè)為30 ℃、40 ℃、50 ℃、60 ℃和70 ℃,超聲時間分別設(shè)為10 min、20 min、30 min、40 min和50 min，超聲功率分別設(shè)為100 W、150 W、200 W和250 W。

1.4.2 響應(yīng)面優(yōu)化實驗設(shè)計

采用Design Expert軟件(8.05b)進行設(shè)計，并采用Box-benhnken設(shè)計試驗法進行優(yōu)化得到最佳的提取方法，共選取超聲功率、提取時間和提取溫度作為3個主要的因素，并且將其作為自變量，響應(yīng)函數(shù)為總?cè)频牡寐剩ㄟ^響應(yīng)曲面分析法，得到回歸方程，最終得出自變量和響應(yīng)函數(shù)之間的統(tǒng)計學(xué)模型，以確立阿里紅總?cè)铺崛〉淖罴训墓に噮?shù)。

在本試驗中，以超聲功率、提取時間、提取溫度作為三個關(guān)鍵的考察因素也就是自變量，三個自變量分別設(shè)為X1、X2、X3，并且分別用-1、0、+1來表示自變量的低、中、高水平，然后再按照相應(yīng)方程式x=(Xi-X0)/ΔX對自變量進行編碼，方程式中x代表自變量的編碼值，Xi代表自變量的真實值，ΔX代表自變量的變化，因素編碼及水平見表1。

表 1 因素編碼水平表

預(yù)測模型是以阿里紅總?cè)扑岬淖罱K得率Y作為響應(yīng)值(評價指標)，此模型得到的二次多項式方程是由最小二乘法擬合而得的

上述方程式中，Y代表預(yù)測響應(yīng)值,β0代表常數(shù)值,βi代表線性系數(shù),βii代表二次項系數(shù),βij代表交互項系數(shù)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結(jié) 果

2.1 UV測定三萜酸含量的方法的建立

2.1.1 確定最佳測定波長

利用高氯酸-香草醛顯色法，即1.2具體步驟操作，然后選擇400～800 nm進行波長掃描，結(jié)果見圖1，從圖中可以看到齊墩果酸對照品溶液在547 nm 處和611 nm處有最大吸收峰，文獻多采用547 nm為阿里紅三萜酸的紫外檢測波長，因此本研究選用547 nm為阿里紅三萜酸的紫外檢測波長。

2.1.2 標準曲線的繪制

以齊墩果酸含量為橫坐標，對應(yīng)的吸光度值為縱坐標繪制標準曲線。結(jié)果見圖2，得到的回歸方程為：Y=28.436X-0.009 2，R2=0.996 8。

從圖2可以看出，不同濃度的齊墩果酸對照品溶液與測得的吸光度值成良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)R2=0.996 8，因此此方法可以用作阿里紅三萜酸含量測定方法。

圖 1 齊墩果酸的UV波長掃描圖

圖 2 齊墩果酸標準曲線

2.2 方法學(xué)考察結(jié)果

2.2.1 精密度與重復(fù)性結(jié)果

用高氯酸-甘草醛法顯色UV測定阿里紅總?cè)扑岷?，精密度相對標準偏?RSD)為0.23%，說明使用的測定方法精密性與準確性良好，而且測定條件易操作，可控性強，測定結(jié)果可信。

2.2.2 穩(wěn)定性試驗結(jié)果

樣品加入顯色劑后在60 min內(nèi)檢測，其吸光度值變化相對穩(wěn)定，RSD為0.45%。表明顯色穩(wěn)定，一定時間內(nèi)測定不會對三萜酸含量產(chǎn)生影響。

2.2.3 回收率實驗結(jié)果

平均回收率為99.91%，RSD為0.48%，表明測定所得的結(jié)果與真實數(shù)值較為接近，準確度較高。實驗數(shù)據(jù)說明該顯色方法測定阿里紅總?cè)扑岷糠衔⒘砍煞址治龅囊?，具有一定的實用價值,具體結(jié)果見表2。

表 2 回收率結(jié)果(n=9)

2.3 超聲波工藝確定結(jié)果

2.3.1 單因素實驗的結(jié)果與分析

為了更好地確定阿里紅三萜酸的提取條件，將幾個影響最終提取率的主要因素進行了單因素考察，結(jié)果如下。

(1)超聲功率對總?cè)扑岬牡寐实挠绊?/p>

超聲提取時間為30 min，提取溫度為30 ℃，選擇不同的超聲功率，對阿里紅總?cè)扑岬牡寐视绊懸妶D3。如圖3所示，當(dāng)超聲功率設(shè)為200 W時，總?cè)扑岬淖詈蟮寐首罡摺．?dāng)超聲功率小于200 W時，隨著超聲頻率的升高，總?cè)扑岬牡寐室仓饾u升高；而當(dāng)超聲功率一旦超過了200 W時，隨著超聲功率的進一步增加，總?cè)扑岬寐蕝s逐漸地下降。因此，超聲功率選擇為200 W是最佳條件。

(2)超聲時間對提取得率的影響

超聲提取溫度為30 ℃，提取功率為200 W，選擇不同的超聲時間，對阿里紅總?cè)扑岬牡寐视绊懸妶D4。如圖4所示，當(dāng)超聲的時間設(shè)為30 min時，阿里紅總?cè)扑岬奶崛〉寐首罡?。?dāng)超聲處理的時間超過30 min時，總?cè)扑峋蜁霈F(xiàn)損失的現(xiàn)象，其提取得率會明顯下降，這說明阿里紅總?cè)扑岬奶崛∵^程與超聲的時間密切相關(guān)，所以選擇最佳提取時間為30 min。

(3)超聲溫度對提取得率的影響

超聲提取時間為30 min，超聲功率為200 W，選擇不同的提取溫度，對阿里紅總?cè)扑岬牡寐视绊懸妶D 5。如圖5所示，當(dāng)超聲提取的溫度低于40 ℃時，升高溫度可以使總?cè)扑岬寐食霈F(xiàn)上升的趨勢，當(dāng)溫度達到40 ℃時，阿里紅總?cè)扑岬牡寐蔬_到了最大值。此時，繼續(xù)升高提取溫度，總?cè)扑岬牡寐蕝s出現(xiàn)了下降的趨勢。據(jù)此，提取溫度設(shè)為40 ℃，是最適宜的溫度。

圖 3 超聲功率對超聲波提取阿里紅總?cè)扑岬寐实挠绊?/p>

圖 4 超聲時間對超聲波提取阿里紅總?cè)扑岬寐实挠绊?/p>

圖 5 超聲溫度對超聲波提取阿里紅總?cè)扑岬寐实挠绊?/p>

2.3.2 響應(yīng)面分析法優(yōu)化阿里紅總?cè)扑岢曁崛」に?/p>

根據(jù)RSM的設(shè)計，共選取17個試驗點，將超聲的功率、時間和溫度3個主要因素設(shè)為自變量，最后以總?cè)扑岬牡寐首鳛镽SM的響應(yīng)值。表3是得率試驗值和模型預(yù)測值。將結(jié)果進行了二次多項回歸擬合，最終獲得了預(yù)測響應(yīng)值Y(得率/%)和功率(A/W)、提取時間(B/min)及提取溫度(C/℃)的一個二次回歸方程：

Y=14.87+1.250E-003X1+0.75X2+0.49X3-

在此二次模型中，回歸系數(shù)的顯著性檢驗(表4)表明：主要因素X1、X2和X3對總?cè)扑岬奶崛⌒Ч木€性效應(yīng)都比較顯著;另外，因素X12和X22對總?cè)扑岬奶崛⌒Ч那嫘?yīng)比較顯著，而X1X2、X1X3和X2X3對總?cè)扑岬奶崛⌒Ч慕换ビ绊懖⒉伙@著。

表 3 阿里紅中總?cè)扑岬寐蕦崪y值與模型預(yù)測值

表 4 回歸方程系數(shù)顯著性檢驗

(1)超聲提取阿里紅總?cè)扑岬牡雀呔€和響應(yīng)面分析及優(yōu)化

圖6可以得出，當(dāng)超聲提取溫度保持不變?yōu)?0 ℃時，提取功率與時間有明顯的相互影響作用。當(dāng)超聲提取溫度不變時，延長超聲的提取時間，總?cè)扑岬牡寐蕰壬吆笙陆?，得出一個峰值；當(dāng)超聲提取功率在中間水平條件時，總?cè)频牡寐首兓容^大；當(dāng)提取時間在中間水平時，總?cè)扑岬牡寐氏鄬^大;而在提取的時間不變時，超聲功率也同樣有上述規(guī)律。分析圖7可以得到，當(dāng)超聲功率處于中間水平，提取時間也處于中間水平時，就可以獲得比較高的得率。

從圖7得出，超聲提取時間為30 min不變時，增加超聲功率與提升超聲提取溫度，總?cè)扑岬牡寐蕰仍黾雍鬁p少，中間出現(xiàn)一個峰值。當(dāng)超聲提取的功率固定時，超聲提取的溫度逐漸上升時，總?cè)扑岬牡寐室搽S之增加。出現(xiàn)這些現(xiàn)象的原因是，超聲提取溫度的提高能夠加快分子解離與擴散的運動速度，進一步加快總?cè)扑岬奈龀鏊俾?并最終提高總?cè)扑岬寐省?/p>

圖8表明，當(dāng)超聲功率為200 W時，總?cè)扑岬牡寐蕰S著超聲的溫度與時間的變化而變化，出現(xiàn)先上升后下降的趨勢。這是因為超聲可以破碎阿里紅的細胞，從而將細胞內(nèi)的阿里紅總?cè)扑崽崛〕鰜?，但是超聲時間過長就可能影響到其化學(xué)結(jié)構(gòu)，進而降低阿里紅總?cè)扑岬牡寐省?/p>

(2)確定阿里紅總?cè)扑嶙罴烟崛l件與驗證實驗

根據(jù)回歸模型，在選取的各個因素的范圍內(nèi)，應(yīng)用Design-Expert軟件分析可得出，超聲波輔助提取阿里紅總?cè)扑岬淖顑?yōu)工藝是：超聲功率245.2 W、提取時間34.3 min、提取溫50.0 ℃，阿里紅總?cè)扑岬寐实念A(yù)測響應(yīng)值是14.89%。最后考慮到條件的可控性，得到最優(yōu)的阿里紅總?cè)扑岬某曁崛」に囀牵撼暪β?50 W、提取時間35 min、提取溫度50 ℃。最后我們用最優(yōu)的超聲提取工藝做了三次平行試驗，計算得出平均的阿里紅總?cè)扑崽崛÷适?4.88%，與預(yù)測的提取得率14.89%近似相等，驗證了我們的預(yù)測結(jié)果，說明以上的回歸方程和實際情況擬合較好，充分地驗證了所建模型的正確性，說明響應(yīng)曲面法適用于阿里紅總?cè)扑岬某曁崛」に嚨幕貧w分析及參數(shù)優(yōu)化。

圖 6 超聲功率和提取時間交互影響得率的響應(yīng)面圖及等高線圖

圖 7 超聲功率與提取溫度交互影響得率的響應(yīng)面圖及等高線圖

圖 8 提取溫度與提取時間交互影響得率的響應(yīng)面圖及等高線圖

3 討 論

由于具有多種結(jié)構(gòu)類型和生理活性作用，真菌的代謝產(chǎn)物成為開發(fā)利用新的天然來源藥物的一個很重要的來源。我們國家的真菌資源十分的豐富，為了更好地開發(fā)利用和更好地尋找新的藥物活性成分，我們提取分離了藥用真菌阿里紅的化學(xué)成分并優(yōu)化了其提取工藝。進行藥物活性成分的提取工藝的研究，得到一個較先進的提取工藝是研究新劑型的必需的前提，成分的最終提取率直接影響到藥物的質(zhì)量和療效。提取工藝的優(yōu)劣能直接影響生藥的利用率以及后期加工的難易，因此，提取工藝的研究是中藥生產(chǎn)實現(xiàn)現(xiàn)代化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，所以，中藥提取工藝的研究及優(yōu)化是必需的，不可或缺的。

用超聲波法提取中藥有效成分是近年來發(fā)展起來的一種新方法。當(dāng)聲波的頻率超過20 kHz時，就叫做超聲波。采用超聲波的方法提取目標產(chǎn)物時，可以使整個提取過程更快速，而且常溫下就能提取，整個提取過程能耗低且可以達到較高的提取率。超聲波提取一般作為輔助提取方式提取目標產(chǎn)物，當(dāng)其應(yīng)用于中藥有效成分的提取時，具有機械攪拌、空化效應(yīng)、強化擴散、熱效應(yīng)、凝聚作用、乳化作用等[4]。與常規(guī)的提取方法比較，超聲波法提取效果好、對有效成分破壞少，因為超聲波能增大物質(zhì)分子運動頻率和速度，增加溶劑穿透力，提高藥物成分溶出速度和溶出數(shù)量[5]。提取溫度的高低、提取溶劑不同、提取時間的長短等等因素,都可以影響到藥物有效成分的最終提取率，要想得到最佳的提取工藝必然需要進行大量的試驗研究，響應(yīng)曲面法是優(yōu)化提取工藝時常采用的方法。

本研究在單因素試驗的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化阿里紅中總?cè)扑岢煞值某曁崛」に嚄l件。實驗數(shù)據(jù)顯示，超聲波輔助提取阿里紅中總?cè)扑岬淖罴压に嚄l件為：超聲功率245.2 W、提取時間34.3 min、提取溫度50.0 ℃，阿里紅總?cè)扑岬寐实念A(yù)測響應(yīng)值為14.89%。最后驗證阿里紅總?cè)扑岬牡寐实睦碚擃A(yù)測值，采取超聲提取的最優(yōu)條件，得到阿里紅總?cè)扑岬膶嶋H得率是14.88%，和理論預(yù)測值大致相等。試驗數(shù)據(jù)說明，應(yīng)用Box-benhnken設(shè)計試驗優(yōu)化超聲波輔助提取阿里紅總?cè)扑岬墓に?，省時省力，科學(xué)性強，而且有很強實際應(yīng)用價值。

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