不同地區(qū)竹葉中多糖的提取測定

喻 謹(jǐn)，岳永德，湯 鋒，姚 曦，王 坤

(國際竹藤中心，北京 100102)

多糖是一類重要的生物活性物質(zhì)，廣泛存在于動物、植物、微生物等有機(jī)體中。在自然界中儲量豐富，主要分為植物多糖、動物多糖和微生物多糖[1]。植物多糖作為藥用始于1943年[2], 大量研究表明多糖具有抗腫瘤、抗氧化、抗輻射、降血糖和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能等方面生理活性[3-10]。竹子是禾本科(Poaceae)竹亞科(Bambusoideae)多年生常綠植物，中國是竹資源大國[11]，竹葉作為傳統(tǒng)的中藥用材，有著悠久的藥用歷史。近年來，人們對竹類主要化學(xué)成分的分析及其開發(fā)利用的研究表明，竹提取物具有良好的抗氧化、抑菌、抗癌、抗衰老等作用[12]。竹葉多糖(bamboo polysaccharide, BPS)是竹葉中一類重要的生理活性成分，是一類中等相對分子質(zhì)量的雜多糖[13]。國內(nèi)關(guān)于竹葉多糖的提取優(yōu)化研究較多，但對竹葉多糖含量的比較以及成分分析的研究較少，而且有一定的差異[14-17]。本文作者對10種不同竹葉多糖的含量比較及其成分分析進(jìn)行了研究，旨在為竹葉多糖的進(jìn)一步研究利用奠定基礎(chǔ)，同時為竹葉資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 實 驗

1.1 試驗材料

斑苦竹(PleioblastusmaculateMcClure)、水竹(PhyllostachysheterocladaOlive)、佛肚竹(BambusaventricosaMcClure)、箬竹(IndocalamustessellatusMunro)和毛苦竹(PleioblastusmaogensisMcClure)采自于四川長寧世紀(jì)竹園，由李本祥工程師鑒定；版納甜龍竹(DendrocalamushamiltoniiNees et Arn. ex Munro)、青皮竹(BambusatextilisMcClure)和龍竹(DendrocalamusgiganteusMunro)采自云南昆明，由王振良老師鑒定；青皮竹(BambusatextilisMcClure)和青稈竹(BamusatuldoidesMunro)采自于福建福州，由黃彪教授鑒定。所有竹葉樣品均陰干，粉碎0.3 mm后保存。

1.2 試劑與儀器

單糖標(biāo)準(zhǔn)品：鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖和半乳糖醛酸，均購自Sigma公司；葡萄糖、苯酚、濃硫酸(98%)、無水乙醇均為分析純，北京化工試劑有限公司。HC-3515高速離心機(jī)(科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司)；ICS3000型高效離子色譜儀(Dionex戴安，美國)；EYELAN-1000旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(日本EYELAN公司)；冷凍干燥儀(美國Labconco公司)。

1.3 竹葉多糖的提取

稱取每種竹葉10 g 分別于(500 mL)具塞三角瓶中，以料液比1 ∶25 (g ∶mL)，加入250 mL蒸餾水，于磁力攪拌器上，80 ℃攪拌提取3 h，提取2次。合并抽濾浸提液，濃縮至100 mL；以80%乙醇醇沉，放置24 h。醇沉后，棄去上清液，以5 000 r/min離心5 min。取沉淀部分并凍干，即得竹葉粗多糖。

1.4 竹葉多糖含量的測定

1.4.1 多糖含量測定 采用苯酚-硫酸法測定多糖[18-19]。取0.5 mL竹葉粗多糖水溶液，按照測定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液吸光度的方法測定其吸光度。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，得到竹葉粗多糖的糖含量。竹葉多糖含量是指竹葉粗多糖占竹葉的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，計算公式如下：

1.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 根據(jù)參考文獻(xiàn)[20]，配制0.1 g/L葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和5%苯酚溶液。按表1配制標(biāo)準(zhǔn)溶液，各管加入苯酚試液1.0 mL，搖勻，迅速滴加濃硫酸5.0 mL，搖勻后放置5 min，置沸水中加熱15 min，冷至室溫后，于482 nm處測定吸光度，做3個平行實驗。以葡萄糖濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出方程y=0.073 4x-0.006 5，R2=0.993 9。

表1 苯酚-硫酸法測定葡萄糖濃度所需各種反應(yīng)液體積

1.5 竹葉多糖成分分析[21]

1.5.1 多糖水解 取0.005 g多糖固體于棕色小瓶中，加入0.125 mL 72% H2SO4，1.35 mL超純水；置于105 ℃烘箱中2.5 h(每30 min搖晃一次)。用0.22 μm濾頭將溶液過濾至小玻璃瓶中，從中取 0.5 mL于另一個玻璃瓶中，加入2 mL超純水(稀釋5倍)。最后從稀釋后小瓶中取1.5 mL于進(jìn)樣瓶中，待進(jìn)樣檢測。

1.5.2 檢測方法 將稀釋后樣品進(jìn)高效離子色譜儀分析，配備脈沖安培檢測器(CAD)及糖分析專用離子交換分析柱(PA-1，4 mm×250 mm)。具體分析條件為：淋洗液濃度為18 mmol/L NaOH并柱后加堿 0.3 mol/L NaOH，流速為1.0 mL/min，分析時間為45 min，然后用0.2 mol/L NaOH沖洗色譜柱 10 min，再用18 mmol/L NaOH以相同流速平衡色譜柱10 min。酸性單糖的分析則采用0.4 mol/L NaOH的流動相，流速為1.0 mL/min分析10 min。得到的色譜圖與標(biāo)準(zhǔn)單糖的保留時間相對應(yīng)，糖含量的計算以已知濃度的單糖的峰面積為標(biāo)準(zhǔn)曲線計算。單糖標(biāo)準(zhǔn)品為鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、木糖和半乳糖醛酸。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2003軟件進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)差分析；采用SPSS 16.0 軟件進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 竹葉多糖含量比較

按1.3節(jié)方法提取竹葉多糖，并按1.4節(jié)方法進(jìn)行竹葉多糖含量測定，結(jié)果見表2。 從表2中可以看出，10種竹葉的多糖含量存在一定差異，總體平均含量為0.41%。福建的青皮竹和青稈竹竹葉中含有多糖最多，分別為0.77%和0.93%；而竹葉含量最低的是長寧佛肚竹，僅有0.18%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于平均水平。青稈竹竹葉多糖含量是總體平均含量的2.27倍。

由表2可以看出，同一地區(qū)不同竹種間多糖含量具有極顯著差異，在四川長寧地區(qū)，除了斑苦竹和箬竹之間差異不顯著之外，其他竹種間都存在顯著差異。在長寧地區(qū)，含量最高的為毛苦竹，0.26%；最低的是佛肚竹，0.18%。在昆明地區(qū)，青皮竹竹葉中的多糖含量僅為0.26%，而龍竹竹葉中多糖含量達(dá)到0.61%，是青皮竹的2.33倍。另外，在不同地區(qū)同一竹種的多糖含量也有很大差異，見表2，福建青皮竹竹葉的多糖含量為0.77%，而昆明青皮竹竹葉的多糖含量為0.26%，僅約為福建的1/3。

表2 竹葉多糖的平均含量

1)不同字母表示經(jīng)LSD檢驗差異極顯著(p=0.01) Means±SD in the same column followed by different letters varied significantly atp=0.01 based on LSD’s test

2.2 竹葉多糖成分分析

按1.5節(jié)方法分析竹葉多糖的成分，結(jié)果見表3。從表3可以看出，本實驗的10種竹葉多糖的單糖組成成分都是由阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖組成的。但是其單糖含量有較大差異。本實驗結(jié)果與文獻(xiàn)[15-17]報道有差異。在這10種竹葉多糖中，阿拉伯糖、半乳糖和葡萄糖的相對含量較高，除了斑苦竹、水竹和毛苦竹外，這3種單糖含量在其他竹種中均超過80%。福建青皮竹和青稈竹葉中的葡萄糖分別高達(dá)54.45%和43.94%；阿拉伯糖和半乳糖在佛肚竹、箬竹、版納甜龍竹和昆明青皮竹中含量相對較高，均在30%以上。

表3 竹葉多糖的單糖相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)

3 結(jié) 論

3.1 采用苯酚-硫酸法測定了10種竹葉粗多糖中的糖含量， 從0.18%到0.93%。最高為福建青稈竹，最低是長寧佛肚竹；并分析比較了不同竹種多糖含量的差異，同一地區(qū)不同竹種的竹葉多糖含量存在極顯著差異，尤以昆明和福建青皮竹最為明顯。

3.2 測定了竹葉多糖的組成成分，由5種單糖組成，分別是阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖；其中阿拉伯糖占18.32%～36.63%，半乳糖占19.16%～38.19%，葡萄糖占16.90%～54.45%，木糖占5.88%～16.32%，甘露糖占1.53%～10.89%。

不同竹葉多糖含量以及多糖的組成成分存在著差異，為更好地開發(fā)利用竹葉多糖提供了一定的科學(xué)依據(jù)；同時為竹葉資源的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

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