奧曲肽對(duì)大鼠急性胰腺炎腺泡死亡方式的影響

曹 勇 蔡 偉 黃林義 張中文

南京醫(yī)科大學(xué)附屬江寧醫(yī)院普外二科 南京 211100

急性胰腺炎(Acute Pancreatitis，AP)是外科常見(jiàn)的急腹癥，其發(fā)病機(jī)制的腺泡細(xì)胞凋亡學(xué)說(shuō)近年來(lái)引人注目［1］，而奧曲肽對(duì)AP 的治療效果已經(jīng)得到臨床普遍認(rèn)可［2］，但其作用機(jī)理尚未完全清楚。本課題試圖通過(guò)奧曲肽誘導(dǎo)胰腺腺泡細(xì)胞凋亡的角度，初步探討其治療胰腺炎的可能作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及試劑 SD 大鼠由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，蛙皮素購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司，原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(TUNEL 試劑盒)、血清淀粉酶(AMY)檢測(cè)試劑盒由南京建成生物工程研究所提供。TaqDNA 聚合酶及緩沖系統(tǒng)、蛋白酶K、脫氧核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶(TdT)、Fluorescein -dUTP、RNA 酶抑制劑(rRNasin)由美國(guó)Promega 公司提供。

1.2 動(dòng)物分組、模型制備 SD 大鼠30 只，雌雄不限，體質(zhì)量250～300 g。將動(dòng)物隨機(jī)分為三組，每組10 只，試驗(yàn)前禁食不禁水12 h。(1)空白對(duì)照組。(2)急性胰腺炎組:麻醉后于大鼠后肢根部皮下注射蛙皮素15 g/只，1 次/h，共4 次。(3)急性胰腺炎治療組:按奧曲肽0.001 mg/kg，后肢根部皮下注射，1 次/8h，制作AP 模型過(guò)程同［2］。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 血清AMY 檢測(cè) 采用碘-淀粉比色法測(cè)定，細(xì)胞凋亡檢測(cè)采用末端脫氧核苷酸介導(dǎo)的dUTP 缺口末端標(biāo)記(TUNEL)法。凋亡指數(shù)(Apoptotic Index，AI)計(jì)算方法:數(shù)4個(gè)高倍鏡視野，每個(gè)視野中計(jì)算250個(gè)腺泡中凋亡細(xì)胞數(shù)。病理組織學(xué)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)按改良Schmidt 法［3］進(jìn)行。

1.3.2 逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)(RT -PCR)檢測(cè) 引物序列均由南京若爾曼生物技術(shù)有限公司合成，引物信息如下:

檢測(cè)步驟:(1)總RNA 的制備。(2)RT 反應(yīng)。(3)PCR 反應(yīng)。(4)反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行PCR 產(chǎn)物電泳。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用Stata7.0 版本進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。測(cè)定數(shù)值以(±s)表示，數(shù)據(jù)間比較采用方差分析，兩兩比較采用q 檢驗(yàn)，兩者間相關(guān)關(guān)系采用直線(xiàn)相關(guān)分析。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠胰腺組織內(nèi)Bax mRNA 經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄-多聚酶鏈反應(yīng)后檢測(cè)的表達(dá)情況 結(jié)果以各組測(cè)得的光密度值與內(nèi)參β -actin 的光密度值之比值表示，見(jiàn)表1。

表1 各組組織內(nèi)Bax mRNA 表達(dá) (±s)

表1 各組組織內(nèi)Bax mRNA 表達(dá) (±s)

注:#與正常對(duì)照組相比P ＜0.05;●與急性胰腺炎組相比P＜0.05

正常對(duì)照組(n=10)急性胰腺炎組(n=10)治療組(n=10)Bax mRNA 0.2196±0.04466 0.3765±0.0566# 0.6959±0.0784#●

2.2 各組血清AMY 與各組病理組織學(xué)評(píng)分情況及胰腺組織細(xì)胞凋亡變化情況 治療組血清AMY、病理組織學(xué)評(píng)分較AP 組均顯著降低(P ＜0.05)，治療組血清胰腺組織細(xì)胞凋亡指數(shù)較AP 組明顯升高(P ＜0.05)，見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠AMY 與TNF-α 水平變化情況 (±s)

表2 各組大鼠AMY 與TNF-α 水平變化情況 (±s)

注:#與正常對(duì)照組相比P ＜0.05;＊與急性胰腺炎組相比P ＜0.05

組別 n AMY(u/l) 細(xì)胞凋亡指數(shù)(AI%)病理組織學(xué)評(píng)分正常對(duì)照組10 604.90 ±114.89 1.45 ±0.33 0.90 ±0.74急性胰腺炎組 10 2235.81 ±466.52# 21.30 ±1.21# 8.20 ±0.79#治療組 10 1342.33 ±222.92#＊ 28.79 ±1.43#＊ 3.80 ±0.92#＊

2.3 各檢測(cè)指標(biāo)間的相關(guān)分析 各組大鼠胰腺腺泡細(xì)胞凋亡指數(shù)與胰腺組織病理學(xué)評(píng)分呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為r2= -0.97(P ＜0.05);各組大鼠胰腺細(xì)胞凋亡指數(shù)與胰腺組織內(nèi)Bax mRNA 之間呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為r3=0.73(P ＜0.05);各組大鼠胰腺組織病理學(xué)評(píng)分與胰腺組織Bax mRNA 之間呈負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為r1= -0.54(P ＜0.05)。

3 討論

急性胰腺炎(AP)的細(xì)胞凋亡學(xué)說(shuō)是近年來(lái)研究AP 發(fā)病機(jī)制的又一個(gè)熱點(diǎn)領(lǐng)域，該學(xué)說(shuō)認(rèn)為［1］:在AP 的發(fā)病過(guò)程中，胰腺腺泡細(xì)胞的凋亡同疾病密切相關(guān)，即腺泡細(xì)胞的凋亡是對(duì)機(jī)體較為有利的一種反應(yīng)，其凋亡程度同AP 病情的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)，胰腺細(xì)胞凋亡越多，則胰腺組織病理學(xué)損害越輕。本課題結(jié)果也顯示:正常對(duì)照組腺泡細(xì)胞的凋亡細(xì)胞很少;AP經(jīng)治療后凋亡指數(shù)較同型明顯上升，其組織病理學(xué)損害的減輕(P ＜0.05);AP 凋亡指數(shù)與胰腺組織病理學(xué)評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(P ＜0.05)，進(jìn)而驗(yàn)證了“細(xì)胞凋亡學(xué)說(shuō)”觀(guān)點(diǎn)。

奧曲肽(sandostatin)是人工合成的生長(zhǎng)抑素的八肽衍生物，為治療急性胰腺炎的主藥，其療效已為臨床認(rèn)可。通常認(rèn)為奧曲肽治療急性胰腺炎的作用機(jī)制包括以下多方面的［4-5］:(1)抑制胃腸道消化液和胰腺外分泌液分泌;(2)抑制內(nèi)分泌激素的分泌、抑制膽囊收縮;(3)抑制炎性細(xì)胞因子的生成和釋放;(4)使膽管括約肌張力降低，從而使胰管內(nèi)壓力下降;(5)改善胰腺炎患者血流動(dòng)力學(xué)、機(jī)體代謝狀態(tài);(6)細(xì)胞保護(hù)作用;(7)減少液體丟失和在第三間隙聚集，降低嚴(yán)重并發(fā)癥的發(fā)生率等。然而，奧曲肽對(duì)AP 的治療作用機(jī)制中，是否涉及誘導(dǎo)腺泡細(xì)胞的凋亡、減輕胰腺組織病理學(xué)的損害，鮮有文獻(xiàn)報(bào)道。

Bax 基因?qū)儆贐cl-2 基因家族。Bcl-2 基因家族是最受關(guān)注的細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因，Bcl -2 家族可形成共聚體促進(jìn)細(xì)胞凋亡［6］。以往有研究證實(shí)Bax 基因是一種凋亡調(diào)控基因［7］，轉(zhuǎn)染Bax 基因后細(xì)胞的凋亡指數(shù)增高。促凋亡基因Bax 表達(dá)上調(diào)，必然使腺泡細(xì)胞凋亡增加，胰腺炎病情的嚴(yán)重程度減輕。通過(guò)本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，奧曲肽治療組與AP 組相比胰腺組織Bax mRNA表達(dá)水平明顯增高(P ＜0.05)，且胰腺組織Bax mRNA 表達(dá)水平與其細(xì)胞凋亡指數(shù)呈顯著正相關(guān)(P ＜0.05)，凋亡指數(shù)亦明顯增高(P ＜0.05)，提示奧曲肽對(duì)大鼠急性胰腺炎的治療作用可能還通過(guò)誘導(dǎo)AP 腺泡細(xì)胞的凋亡這一途徑，進(jìn)一步減輕AP 的病情。

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