利用酶抑制速測儀檢測桑葉農(nóng)藥殘留方法探討

董久鳴 陳偉國 孫海燕 楊一平 張 芬

(1浙江省農(nóng)技推廣中心，杭州 310020;2海寧市蠶桑技術(shù)服務(wù)站，浙江海寧 314400)

桑園及周邊農(nóng)作物使用農(nóng)藥污染桑葉極易導(dǎo)致養(yǎng)蠶中毒損失，如何快速、有效檢測桑葉中農(nóng)藥殘留是保障蠶桑生產(chǎn)安全的重要措施。農(nóng)藥殘留檢測方法有氣相色譜法、液相色譜法、薄層色譜法翻，但儀器昂貴、處理繁瑣、耗時較長，對儀器的使用條件和操作人員的要求比較嚴(yán)格，只適用于實(shí)驗(yàn)室檢測。近年來，隨著對快速檢測方法的需求，以酶抑制法為代表的快速檢測方法因具有高效、快捷、經(jīng)濟(jì)、實(shí)時、現(xiàn)場、覆蓋率高等特點(diǎn)得到迅速發(fā)展，已在蔬菜、水果等農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全監(jiān)管中得到廣泛應(yīng)用，檢測對象為目前使用量最大的有機(jī)磷和氨基甲酸酯兩大類農(nóng)藥。已被國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 5009.199—2003《蔬菜中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量快速檢測》、GB/T 18630—2002《蔬菜中有機(jī)磷及氨基甲酸酯農(nóng)藥殘留量的簡易檢驗(yàn)方法酶抑制法》和農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)NY/T 448—2001《蔬菜上有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘毒快速檢測方法》所采用。目前，國內(nèi)市場上已有20多家生產(chǎn)商研制的具有農(nóng)藥殘留快速檢測功能的儀器裝備40多種［1-5］。近年來，我們將農(nóng)藥殘留速測儀應(yīng)用于桑葉農(nóng)藥殘留的快速檢測，以探索蠶桑生產(chǎn)安全防范的新措施。

1 酶抑制率法檢測農(nóng)藥殘留的原理

利用有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥對動物體內(nèi)乙酰膽堿酯酶(AChE)具有抑制作用的原理，在AChE及其底物乙酰膽堿(ACh)的共存體系中加入檢測樣品的提取液，如果樣品中不含有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥(或殘留量低)，酶的活性就不被抑制，ACh就會被酶水解，水解產(chǎn)物與加入的顯色劑反應(yīng)產(chǎn)生黃色物質(zhì);反之，如果檢測樣品的提取液中含有一定量的有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥，酶的活性就被抑制，試樣中加入的底物就不能被酶水解，當(dāng)加入顯色劑時就不顯色或顏色變化很小。用分光光度計在412nm 下測定吸光度隨時間的變化值，計算出抑制率，通過抑制率可以判斷出檢測樣品中是否有高劑量有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥的存在［2，6］。抑制率計算公式如下:

抑制率(%)=［(ΔAo-ΔAt)/ΔAo］×100

式中:ΔAo—空白對照溶液反應(yīng)3min 吸光度的變化值，ΔAt—檢測樣品溶液反應(yīng)3min 吸光度的變化值。

2 試劑與儀器

2.1 儀器

分光光度計或相應(yīng)的農(nóng)藥殘毒快速檢測儀，常量天平，冰箱，振蕩器。

2.2 試劑

緩沖溶液 11.9g 無水磷酸氫二鉀與3.2g 磷酸二氫鉀，用1 000mL 蒸餾水溶解。

顯色劑 160mg 二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)和15.6mg 碳酸氫鈉，用20mL 緩沖溶液溶解，4℃冰箱中保存。

底物 25.0mg 硫代乙酰膽堿，加3.0mL 蒸餾水溶解，搖勻后置4℃冰箱中保存?zhèn)溆?。保存期不超過兩周。

乙酰膽堿酯酶 根據(jù)酶的活性情況，用緩沖溶液溶解，3min 的吸光度變化ΔAo 值應(yīng)控制在0.3 以上。搖勻后置4℃冰箱中保存?zhèn)溆?，保存期不超過4 天。

各種農(nóng)藥殘毒快速檢測儀生產(chǎn)商均可供應(yīng)相應(yīng)的試劑和配制方法。

3 檢測方法

3.1 空白對照測試

將2.5mL 緩沖溶液加入試管中，再加入0.lmL酶液、0.1mL 顯色劑、0.lmL 底物，迅速搖勻后倒入比色皿，立即放入儀器比色池中，記錄反應(yīng)3min 的吸光度變化值ΔAo。

3.2 樣品處理

選取有代表性的桑葉樣品，用清水沖洗表面塵泥，剪成1～2cm 寬的長方條，稱取1g 樣品，放入提取瓶中，加入5mL 緩沖溶液，振蕩1～2min 后靜置待用。

3.3 樣品溶液測試

在試管中加入2.5mL 樣品提取液，其它操作與空白對照溶液測試相同，記錄反應(yīng)3min 的吸光度變化值ΔAt。

3.4 檢測結(jié)果的判定

檢測結(jié)果以酶被抑制的程度(抑制率)表示。當(dāng)檢測樣品提取液對酶的抑制率≥50%時為陽性，表示樣品中有高劑量有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥存在;當(dāng)檢測的抑制率≤50%時為陰性，表示樣品中有機(jī)磷或氨基甲酸酯類農(nóng)藥不存在或含量很低。目前使用的農(nóng)藥殘留快速檢測儀大多具有檢測結(jié)果自動判定顯示功能，抑制率≥50%時顯示為不合格，抑制率≤50%時顯示為合格。

4 酶抑制法快速檢測桑葉農(nóng)藥殘留應(yīng)用前景

酶抑制率檢測方法的優(yōu)點(diǎn)主要是前處理簡單、檢測時間短，所需儀器和試劑價格低廉，特別適合在短時間內(nèi)對大批樣品的篩選檢測。目前，農(nóng)貿(mào)市場和無公害農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)基地大多已配備此類檢測設(shè)備。但在應(yīng)用于桑葉農(nóng)藥殘留檢測時，尚需結(jié)合蠶桑生產(chǎn)特點(diǎn)。

4.1 檢測對象的局限性

酶抑制法只能檢測有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留，不能檢測有機(jī)氯、擬除蟲菊酯、抗生素等其它農(nóng)藥。因此，以酶抑制法的檢測結(jié)果并不能作為對家蠶安全的唯一依據(jù)，當(dāng)然在明確檢測有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的情況除外。

4.2 檢測結(jié)果的適用性

不同植物的組織液、次生物質(zhì)、葉綠素等都會干擾酶的反應(yīng)，改變吸光度，影響檢測結(jié)果［7-8］。GB/T 5009.199—2003 是針對蔬菜樣品，以抑制率≥50%為陽性結(jié)果，表示農(nóng)藥殘留超標(biāo)(不合格)。但這一判定標(biāo)準(zhǔn)是否適用于桑葉上農(nóng)藥殘留量對家蠶生物毒性的評判尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

4.3 檢測方法的可行性

盡管酶抑制法快速檢測桑葉農(nóng)藥殘留存在一些不足，但并不能否定其應(yīng)用價值。GB/T 5009.199—2003 中規(guī)定了酶抑制率法對部分農(nóng)藥的檢測靈敏度指標(biāo)，如辛硫磷為0.3mg/kg，敵百蟲為0.2 mg/kg，滅多威為0.1mg/kg;而這些農(nóng)藥對家蠶的急性毒性(LC50)為辛硫磷0.887 2 mg/L、敵百蟲11.120 0mg/L、滅多威9.200 9mg/L［9-10］?？梢?，酶抑制率法對部分有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢出限明顯低于其對家蠶的急性毒性，因此，作為預(yù)知檢測手段具有可行性。

4.4 需要解決的主要問題

一是探索針對桑葉特點(diǎn)的檢測方法，減少各種干擾因素，上提高檢測準(zhǔn)確度和可靠性。桑葉表面塵土對透光度的影響，桑葉樣品提取過程中組織液滲出的多少，不同部位桑葉的葉綠素差異，多種因素都有可能對比色結(jié)果產(chǎn)生干擾。需要經(jīng)過大量對比試驗(yàn)，提出適用性較強(qiáng)的優(yōu)化檢測方法，降低出現(xiàn)假陽性現(xiàn)象。

二是建立有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥主要品種的殘留檢測結(jié)果與對家蠶的生物毒性對應(yīng)數(shù)據(jù)庫。由于各種農(nóng)藥的內(nèi)吸、揮發(fā)、降解等性質(zhì)差異，在桑葉上的殘留量和降解時間相差極大，對家蠶的毒性等級也不一樣。因此，利用酶抑制法快速檢測桑葉中有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留結(jié)果必須與對家蠶的殘毒期生物測定相對應(yīng)，對主要的農(nóng)藥品種建立比對數(shù)據(jù)庫，對檢測結(jié)果提出校正參考值。

三是正確應(yīng)用好酶抑制檢測技術(shù)，為預(yù)防家蠶農(nóng)藥中毒提供有效的輔助手段。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識到引起家蠶農(nóng)藥中毒的復(fù)雜性，和酶抑制檢測技術(shù)的局限性，因此要揚(yáng)長避短，發(fā)揮優(yōu)勢。目前有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥約占70%［1］，在危險時期、危險區(qū)域，對桑葉農(nóng)藥殘留進(jìn)行快速篩查，并結(jié)合生物試驗(yàn)，可有效降低家蠶中毒風(fēng)險，促進(jìn)蠶桑生產(chǎn)穩(wěn)定，使傳統(tǒng)產(chǎn)業(yè)繼續(xù)為農(nóng)業(yè)增效、農(nóng)民增收發(fā)揮積極作用。

［1］欒云霞，李楊，平華等.基于酶抑制法的農(nóng)藥殘留快速檢測儀器現(xiàn)狀及評價［J］.食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2012，3(6):690-694.

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［3］GB/T 18630—2002.蔬菜中有機(jī)磷及氨基甲酸酯農(nóng)藥殘留量的簡易檢驗(yàn)方法酶抑制法［S］.2002.

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