HBV相關(guān)肝細(xì)胞癌組織中CDC37基因啟動(dòng)子微衛(wèi)星多態(tài)性及其與基因表達(dá)的關(guān)系

陳朝武，劉 宇，徐 瑩，楊貴奉，王戰(zhàn)會(huì)，姜榮龍

(南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院，廣州510515)

微衛(wèi)星是一種廣泛存在于生物基因組中的由1～6個(gè)核苷酸組成的簡單串聯(lián)重復(fù)序列，又稱為短串聯(lián)重復(fù)序列或簡單重復(fù)序列。人類基因組中二核苷酸重復(fù)序列(CA/GT)n是最為常見的微衛(wèi)星形式之一，n為重復(fù)次數(shù)，通常為15～60次。微衛(wèi)星具有高度的多態(tài)性和個(gè)體特異性，并且可以穩(wěn)定遺傳。CDC37蛋白是一種與細(xì)胞分裂周期有關(guān)的蛋白，能特異性地與未成熟的蛋白激酶結(jié)合并進(jìn)而與熱休克蛋白90結(jié)合，使蛋白激酶正確折疊和成熟。CDC37蛋白作為一種重要的蛋白激酶特異性輔助分子伴侶，與腫瘤發(fā)生過程中多條信號(hào)通路的活化密切相關(guān)［1，2］。我們的研究發(fā)現(xiàn)，CDC37在肝細(xì)胞癌(HCC)組織中的表達(dá)明顯高于癌旁組織和正常肝組織，那么CDC37基因啟動(dòng)子區(qū)是否存在微衛(wèi)星多態(tài)性，微衛(wèi)星多態(tài)性是否會(huì)影響CDC37的表達(dá)，從而影響HCC的發(fā)生和發(fā)展，目前還未見相關(guān)報(bào)道。為此，我們對(duì)乙型肝炎病毒(HBV)相關(guān)HCC患者的癌組織和癌旁組織中CDC37基因啟動(dòng)子序列進(jìn)行了觀察，并對(duì)癌組織和癌旁組織中CDC37啟動(dòng)子微衛(wèi)星多態(tài)性的組成形式進(jìn)行了分析?，F(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 2012～2013年在南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院接受手術(shù)治療的HBV相關(guān)HCC患者22例，男18例，女4例;年齡28～71歲。術(shù)中分別留取其腫瘤組織(HCC組織)及癌旁正常肝組織(癌旁組織)。有13例患者的HCC組織中CDC37表達(dá)水平高于相應(yīng)癌旁組織(CDC37過表達(dá))，9例患者的HCC組織中CDC37表達(dá)水平不高于相應(yīng)癌旁組織(CDC37無過表達(dá))。

1.2 HCC組織及癌旁組織DNA的提取 每例份組織標(biāo)本稱取30 mg，采用組織基因組DNA提取試劑盒TIANamp Genomic DNA Kit(TIANGEN公司)提取基因組DNA，最后用NANO DROP2000檢測所提DNA的純度及濃度。

1.3 CDC37啟動(dòng)子序列的擴(kuò)增、克隆、測定及比對(duì)以提取的DNA為模板對(duì)CDC37啟動(dòng)子含微衛(wèi)星區(qū)段序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物序列由上海英濰捷基生物技術(shù)有限公司合成，上游引物序列:5'-ATTATCCTGGT-ATCAAAGCGTG-3'，下游引物序列:5'-GACCTAAGCCTGCGCTGGA-3'。PCR反應(yīng)體系共30 μL:基因組 DNA 3 μL，10 × Buffer 3 μL，上下游引物各 0.3 μL，dNTP 2.4 μL，Taq 酶 0.3 μL，去離子水20.7 μL。PCR循環(huán)參數(shù)為94℃預(yù)變性5 min后，進(jìn)行 35 個(gè)循環(huán):94 ℃、30 s，55 ℃、30 s，72 ℃、40 s，最后72℃延伸5 min。

采用PCR產(chǎn)物純化試劑盒(TIANGEN公司)回收、純化PCR產(chǎn)物。將純化后產(chǎn)物與PMD-18T Vector(TaKaRa公司)進(jìn)行TA克隆連接反應(yīng)，反應(yīng)體系共 10 μL(滅菌蒸餾水 1 μL，SolutionⅠ連接緩沖液5 μL，PMD-18T Vector 1 μL，純化 DNA 3 μL)，4 ℃條件下連接12～18 h。將上述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌JM109，取適量菌液均勻涂抹于氨芐抗性LB平板上，37℃過夜培養(yǎng)。挑取單克隆培養(yǎng)后PCR鑒定陽性克隆，最后每例組織標(biāo)本至少送3個(gè)克隆進(jìn)行測序。采用Mega5.05軟件對(duì)測序結(jié)果進(jìn)行排列，并與CDC37啟動(dòng)子參照序列進(jìn)行比對(duì)，對(duì)不同組織標(biāo)本中CDC37啟動(dòng)子微衛(wèi)星多態(tài)性進(jìn)行分析。1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件。組間微衛(wèi)星模式分布比較用Fisher確切概率法，兩個(gè)率的比較用χ2檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC組織及癌旁組織中CDC37基因啟動(dòng)子區(qū)微衛(wèi)星形式 22例患者的癌組織共有93個(gè)克隆進(jìn)行了序列分析，癌旁組織共有101個(gè)克隆進(jìn)行了序列分析。測序結(jié)果表明CDC37基因的啟動(dòng)子區(qū)存在(GT)n1-GC-(GT)n2微衛(wèi)星形式，位于CDC37啟動(dòng)子區(qū)的1 368～1 415位;主要的組成形式中n1有8、9、10共3種重復(fù)形式，n2有8～13共6種重復(fù)形式;(GT)n1和(GT)n2以多種不同的組合方式存在，其中n1為10的組合方式最為多樣，(GT)10-GC-(GT)9最為常見，其次為(GT)10-GC-(GT)12和(GT)10-GC-(GT)13兩種形式;其中(GT)8-GC-(GT)13、(GT)9-GC-(GT)9、(GT)9-GC-(GT)10、(GT)9-GC-(GT)12、(GT)9-GC-(GT)13、(GT)10-GC-(GT)8、(GT)10-GC-(GT)9、(GT)10-GC-(GT)10、(GT)10-GC-(GT)11、(GT)10-GC-(GT)12、(GT)10-GC-(GT)13、其他形式在HCC組織(共93個(gè)克隆)中分別為 0、7、1、4、3、3、31、2、2、17、13、10 個(gè)克隆，在癌旁組織(共101 個(gè)克隆)中分別為 2、9、1、0、4、4、40、0、0、17、19、5 個(gè)克隆。HCC 組織主要有 10 種微衛(wèi)星組成形式，癌旁組織主要有8種，但兩組之間不同組合形式的微衛(wèi)星分布相比，P＞0.05。

2.2 CDC37基因啟動(dòng)子區(qū)微衛(wèi)星形式與CDC37表達(dá)的關(guān)系 13例份HCC組織中CDC37過表達(dá)者，其HCC組織克隆數(shù)為66個(gè)、癌旁組織克隆數(shù)為67個(gè);9例份HCC組織中CDC37無過表達(dá)者的HCC組織克隆數(shù)為27個(gè)。微衛(wèi)星(GT)9-GC-(GT)9、(GT)9-GC-(GT)10、(GT)9-GC-(GT)12、(GT)9-GC-(GT)13、GT)10-GC-(GT)8、(GT)10-GC-(GT)9、(GT)10-GC-(GT)10、(GT)10-GC-(GT)11、(GT)10-GC-(GT)12、(GT)10-GC-(GT)13、其他形式在 13 例份HCC組織中CDC37過表達(dá)者的HCC組織中分別為 6、1、4、2、2、29、2、1、5、8、6 個(gè)克隆，在其癌旁組織中分別為 5、1、0、5、4、33、0、0、5、14、1 個(gè)克隆，在9例份HCC組織中CDC37無過表達(dá)者的HCC組織中分別為 1、0、0、1、1、2、0、1、12、5、4 個(gè)克隆。13 例肝癌組織中CDC37過表達(dá)者的HCC組織和癌旁組織中微衛(wèi)星組成形式總體分布相比，P＞0.05。13例CDC37過表達(dá)者和9例無過表達(dá)者HCC組織中CDC37啟動(dòng)子微衛(wèi)星組成形式相比，P＜0.05;其中(GT)10-GC-(GT)9形式在CDC37過表達(dá)者中所占比例高于無過表達(dá)者，兩者相比，χ2=11.508、P＜0.05，(GT)10-GC-(GT)12形式在 CDC37 無過表達(dá)者中所占比例高于過表達(dá)者，兩者相比，χ2=15.055、P＜0.05。

3 討論

HCC是一種遺傳與環(huán)境共同作用所致的、多基因參與的疾病，HBV和丙型肝炎病毒的感染、含黃曲霉素B1食物的攝入及過度飲酒是HCC發(fā)生的主要危險(xiǎn)因素［3］，但參與其腫瘤發(fā)生的分子機(jī)制尚未完全明了。近年來的腫瘤遺傳學(xué)研究表明，細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化與其遺傳物質(zhì)(基因組)的不穩(wěn)定性有關(guān)，基因組的不穩(wěn)定性主要表現(xiàn)為雜合性缺失和微衛(wèi)星不穩(wěn)定(MSI)。

微衛(wèi)星序列廣泛存在于真核和原核生物的基因組中，可定位于基因的啟動(dòng)子、內(nèi)含子及外顯子等區(qū)域，它可引起啟動(dòng)子區(qū)DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的改變，并導(dǎo)致與RNA聚合酶和轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合能力發(fā)生改變，從而影響基因的表達(dá)［4］。微衛(wèi)星異常是基因組不穩(wěn)定的重要分子標(biāo)志，微衛(wèi)星序列除了參與基因表達(dá)調(diào)控，還參與基因重排與變異、維持基因組穩(wěn)定等。微衛(wèi)星多態(tài)性對(duì)于腫瘤的早期診斷［5］及腫瘤類型［6］、分期與轉(zhuǎn)移［7］、預(yù)后判斷［8］等都有重要意義。

本研究發(fā)現(xiàn)，CDC37基因的啟動(dòng)子區(qū)存在著(GT)n串聯(lián)重復(fù)序列。作為蛋白激酶特異性的輔助分子伴侶CDC37在腫瘤細(xì)胞的生長、分裂、分化過程中起關(guān)鍵作用，近年來已成為抗腫瘤藥物研究的熱點(diǎn)，針對(duì)CDC37及其復(fù)合物抑制劑的研究也在不斷進(jìn)展中［9］。如果能夠明確CDC37啟動(dòng)子微衛(wèi)星多態(tài)與其過表達(dá)及HCC發(fā)生和進(jìn)展之間的關(guān)系，有助于在HCC的發(fā)展過程中進(jìn)行早期診斷和干預(yù)。在本研究的整個(gè)研究群體中，其CDC37基因的啟動(dòng)子區(qū)(GT)n1-GC-(GT)n2微衛(wèi)星形式中n1的重復(fù)次數(shù)在8～10，以10最為常見;n2重復(fù)次數(shù)為8～13，以9最為常見。(GT)n1-GC-(GT)n2最常見的形式為(GT)10-GC-(GT)9，占36.60%。在 HCC組織和癌旁組織中，(GT)n1-GC-(GT)n2的總體分布沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，最常見的形式都是(GT)10-GC-(GT)9。CDC37過表達(dá)的HCC組織與相應(yīng)癌旁組織微衛(wèi)星多態(tài)性的總體分布亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，最常見的形式都是(GT)10-GC-(GT)9。HCC組織中CDC37過表達(dá)者和無過表達(dá)者微衛(wèi)星多態(tài)性存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，其中(GT)10-GC-(GT)9在過表達(dá)者和無過表達(dá)者中的比例分別為 43.94%和 7.41%，而(GT)10-GC-(GT)12在兩者中分別占7.58%和44.44%，這兩種多態(tài)性在過表達(dá)者和無過表達(dá)者中的分布都有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，這種差異是否與CDC37的表達(dá)有關(guān)有待進(jìn)一步研究。

研究［10］表明，富含AC/GT的微衛(wèi)星序列能形成左旋雙螺旋的Z-DNA結(jié)構(gòu)。AC/GT微衛(wèi)星長度的變化能調(diào)控基因的表達(dá)［11］，進(jìn)而影響人類的相關(guān)表型［12］。體內(nèi)外研究［13］表明，血紅素氧化酶-1 啟動(dòng)子(GT)n序列重復(fù)數(shù)目的改變可影響其轉(zhuǎn)錄，長的重復(fù)序列可導(dǎo)致低水平表達(dá)，但具體機(jī)制還不清楚。血紅素氧化酶-1是一種重要的保護(hù)因子，具有抗炎、抗氧化、抗凋亡以及抗增生的作用，其啟動(dòng)子多態(tài)性與心血管并發(fā)癥相關(guān)［14］。而CDC37基因啟動(dòng)子區(qū)的GT微衛(wèi)星多態(tài)性是否會(huì)通過DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化而影響啟動(dòng)子的活性，進(jìn)而影響CDC37的表達(dá)，從而影響HCC的發(fā)生和發(fā)展，目前尚不清楚。本研究只對(duì) CDC37啟動(dòng)子微衛(wèi)星多態(tài)性與CDC37表達(dá)的相關(guān)性做初步探討，還需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量加以研究，并通過體外實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證不同的微衛(wèi)星形式對(duì)其啟動(dòng)子活性的影響，才能明確該微衛(wèi)星形式與CDC37表達(dá)的關(guān)系，并進(jìn)一步明確其與HBV相關(guān)HCC的相關(guān)性，為臨床診治HBV相關(guān)HCC提供理論依據(jù)。

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