NVP-BEZ235對卵巢癌細(xì)胞系SKOV3增殖及體內(nèi)、體外遷移的影響

秦 宇，賴慧玲，趙雪嬌，王常玉

0 引言

卵巢癌是女性第七大致死癌癥相關(guān)性疾病，并且是第二大常見婦科惡性腫瘤[1]。近30年來，雖然醫(yī)療及科研工作者在各種層面對卵巢癌進(jìn)行研究、嘗試，但卵巢癌患者的5年生存率一直保持在30%左右，并未得到極大改善[2]。近年來，由于人們對卵巢癌發(fā)生的內(nèi)在分子機制的了解不斷加深，更特異的分子通路靶向治療得到極大重視。其中PI3K-mTOR通路在卵巢癌中被發(fā)現(xiàn)普遍活化，且參與卵巢癌細(xì)胞的生存、增殖、耐藥及侵襲轉(zhuǎn)移。因此，PI3K-mTOR通路相應(yīng)抑制劑雷帕霉素及雷帕霉素類似物在卵巢癌的治療過程中得到了極大重視。NVP-BEZ235是一種PI3K-mTOR 雙通路抑制劑，不僅可以顯著抑制PI3K活性，同時也能抑制mTOR復(fù)合體活性，在前列腺癌、結(jié)腸癌及乳腺癌等惡性腫瘤中通過引起細(xì)胞周期阻滯、細(xì)胞凋亡抑制腫瘤增殖[3-5]。比傳統(tǒng)mTOR通路抑制劑雷帕霉素及類似物更具殺傷效應(yīng)。本文通過研究NVP-BEZ235對卵巢癌細(xì)胞系SKOV3體外、體內(nèi)轉(zhuǎn)移的影響，檢測PI3K-mTOR通路抑制劑在治療卵巢癌方面的可能性。

1 材料和方法

1.1 儀器 全波段酶標(biāo)儀(美國 Bio-tek公司)；相差顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；熒光體式顯微鏡(日本OLYMPUS公司)；細(xì)胞培養(yǎng)箱(美國Termo公司)；Western Blot電泳及轉(zhuǎn)膜儀(美國 Bio-rad)。試劑：NVP-BEZ235(美國Cayman公司)；CCK-8(日本Dojindo公司)；P-AKT、P-mTOR一抗(美國Cell signal公司);GAPDH一抗(中國三鷹公司)；SKOV3卵巢癌細(xì)胞系(美國ATCC公司)；Transwell小室(美國Corning公司)；Mcoy5a培養(yǎng)基(中國博士德公司)；胎牛血清(中國四季青公司)。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及藥物預(yù)處理 人卵巢癌細(xì)胞系SKOV3置于Mcoy5a完全培養(yǎng)基(10%胎牛血清，DMEM培養(yǎng)液)中，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細(xì)胞融合率達(dá)90%時進(jìn)行胰蛋白酶消化，傳代或種于孔板進(jìn)行下一步實驗。按照實驗?zāi)康姆譃閷φ战M和NVP-BEZ235處理組，對照組中細(xì)胞不加NVP-BEZ235，處理組培養(yǎng)基中給予125 nmol/mL和250 nmol/mL NVP-BEZ235持續(xù)加藥。

1.2.2 CCK8法測NVP-BEZ235對卵巢癌細(xì)胞SKOV3增殖抑制試驗 將胰酶消化過的SKOV3單細(xì)胞懸液在調(diào)整密度后，以每孔100 μL體積，1×104接種于96孔板中，貼壁24 h后，加入含NVP-BEZ235濃度為0、125、250、500、1 000 nM的100 μL培養(yǎng)基，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至48 h，加入37 ℃預(yù)熱的Cell counting kit-8(Dojindo，日本)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，酶標(biāo)儀450 nm處讀取吸光度值。計算生長抑制率(IR)：IR=[(對照組-實驗組)/對照孔]×100%。實驗重復(fù)3次。

1.2.3 構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光蛋白(GFP)的SKOV3細(xì)胞株 將SKOV3細(xì)胞以每孔5×104接種至12孔板中(1 mL)，融合率為30%～50%，加入GFP慢病毒，并用5 μg/polybrene提高感染率。等細(xì)胞長滿后傳代擴增。

1.2.4 免疫印跡法檢測NVP-BEZ235對PI3K-mTOR通路的抑制 胰酶消化對照組和處理組細(xì)胞，再用PBST洗3次，加細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞總蛋白質(zhì)，用BCA法測蛋白濃度后，加蛋白上樣液，加熱變性后取40 μg進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)移到PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫孵育30 min，分別用P-AKT(1∶1 000)，P-mTOR(1∶1 000)抗體4 ℃孵育過夜，洗滌3次，再用相應(yīng)辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗(1∶4 000)孵育1 h，PBST洗膜3次，采用ECL試劑盒反應(yīng)，Bio-Rad成像系統(tǒng)采集圖像。

1.2.5 體外遷移試驗 將消化成單細(xì)胞懸液的對照組和處理組SKOV3細(xì)胞以2×104個細(xì)胞，200 μL含2% FBS Mcoy5a培養(yǎng)基的體積種于transwell上層小室中，下層中加入500 μL 5% FBS Mcoy5a培養(yǎng)基。繼續(xù)于37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40 h。用棉簽輕輕擦去未穿過的細(xì)胞后用PBS洗3遍，再用4%多聚甲醛固定15 min。PBS洗3遍，再用結(jié)晶紫染色，后再用PBS將多余結(jié)晶紫洗凈。隨機取5個視野，取平均數(shù)，重復(fù)3次實驗。遷移抑制率=[(對照組平均數(shù)-實驗組平均數(shù))/對照組平均數(shù)]×100%。

1.2.6 斑馬魚體內(nèi)遷移試驗 對照組與實驗組細(xì)胞用正義表達(dá)綠色熒光蛋白的慢病毒轉(zhuǎn)染48 h后，用顯微注射儀注射約200個細(xì)胞于2 d大的斑馬魚胚胎卵黃囊中，每組10只。注射48 h后，用熒光體式顯微鏡觀察并拍攝、計數(shù)尾部細(xì)胞轉(zhuǎn)移情況。遷移抑制率=[(對照組平均數(shù)-實驗組平均數(shù))/對照組平均數(shù)]×100%。

2 結(jié)果

2.1 CCK-8法檢測NVP-BEZ235抑制卵巢癌SKOV3增殖 使用濃度分別為125、250、500、1 000 nM NVP-BEZ235對SKOV3作用48 h，通過CCK-8法檢測NVP-BEZ235對卵巢癌的增殖影響，發(fā)現(xiàn)NVP-BEZ235在濃度為125、250 nM時，對SKOV3細(xì)胞增殖抑制差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，而濃度在500～1 000 nM時，對SKOV3細(xì)胞有抑制增殖的作用(P<0.05)。見表1。

表1 NVP-BEZ235對SKOV3細(xì)胞體外增殖的影響

2.2 NVP-BEZ 235顯著抑制PI3K-mTOR通路 Western blot結(jié)果表明，在NVP-BEZ235濃度為125、250 nM時與對照組相比，PI3K-mTOR通路中的AKT及mTOR的磷酸化水平顯著抑制。見圖1。

2.3 NVP-BEZ235抑制SKOV3細(xì)胞體外遷移選取對卵巢癌無增殖抑制的低濃度125、250 nM NVP-BEZ235處理后的細(xì)胞種植在Transwell小室，24 h后通過隨機選取5個視野計數(shù)，結(jié)果表明，該濃度下明顯抑制SKOV3細(xì)胞的體外遷移，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表2。

圖1 NVP-BEZ235抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞中PI3K-mTOR通路

注：A：對照組，B：NVP-BEZ235 125 nM處理組，C：NVP-BEZ235 250 nM處理組

2.4 NVP-BEZ235抑制卵巢癌斑馬魚體內(nèi)遷移與對照組未處理的卵巢癌細(xì)胞相比，NVP-BEZ235 250 nM處理后的細(xì)胞在斑馬魚尾部的熒光點明顯減少，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，NVP-BEZ235顯著抑制了SKOV3細(xì)胞在斑馬魚體內(nèi)的轉(zhuǎn)移。見表3、圖2。

表2 NVP-BEZ235對SKOV3細(xì)胞體外遷移的影響(n=3)

注：P值為與對照組比

表3 NVP-BEZ235對SKOV3細(xì)胞體內(nèi)遷移的影響(n=10)

注：P值為與對照組比

圖2 NVP-BEZ235抑制卵巢癌SKOV3細(xì)胞斑馬魚體內(nèi)轉(zhuǎn)移(綠色熒光點為轉(zhuǎn)移灶細(xì)胞)

3 討論

PI3K-mTOR通路是調(diào)控細(xì)胞生長過程的關(guān)鍵通路，在多種惡性腫瘤中存在異?；罨痆6]。PI3K-mTOR通路可以通過多種方式激活，其中包括PTEN的缺失或突變[7]、PIK3CA的突變[8]以及mTOR復(fù)合體的調(diào)控異常[9]等等。抑制該通路可以降低腫瘤細(xì)胞增殖、引起細(xì)胞自噬，同時增加癌細(xì)胞對化療的敏感性，但是對正常細(xì)胞卻沒有影響[4]，因此，被認(rèn)為是改善治療結(jié)果的一個很好的靶點。PI3K-mTOR信號通路同樣在卵巢癌中也存在異?；罨鶕?jù)美國癌癥和腫瘤基因圖譜(TCGA)最近公布的數(shù)據(jù)表明，約有34%的卵巢癌樣本中存在PI3K-mTOR通路異常，提示此通路在卵巢癌的發(fā)生發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用[10]。目前mTOR抑制劑已開發(fā)出三代，第一代以Rapamycin為代表，雖可部分抑制mTOR通路活性，但存在通過PI3K而引起生存通路ERK/RSK2、Akt和Mnk/eIF4F等的負(fù)反饋激活現(xiàn)象，導(dǎo)致療效減弱的問題[11]。第二代為mTOR的ATP競爭性抑制劑，如PP242、INK126、Torin1等，可完全抑制mTOR的激酶活性，而取得更好的腫瘤細(xì)胞殺傷效果[12]。目前，前兩代抑制劑已經(jīng)有部分藥物進(jìn)入臨床前期研究且取得了不錯進(jìn)展。第三代以NVP-BEZ235為代表，其是一種新型的PI3K、mTOR雙通路抑制劑。不僅能在降低mTOR的激酶活性的基礎(chǔ)上同時抑制PI3K的激酶活性，避免了第一代mTOR抑制劑存在的負(fù)反饋激活生存通路問題，而有效地增加了mTOR通路的抑制效果。NVP-BEZ235通過拮抗PI3K/mTOR信號通路，可引起細(xì)胞周期阻滯、自噬等殺傷效應(yīng)，在很多腫瘤中有很好的治療前景[6]。本研究中，隨著NVP-BEZ235濃度的增高，SKOV3的增殖能力被顯著抑制且呈劑量依賴關(guān)系。本實驗通過免疫印記法檢測到，當(dāng)SKOV3細(xì)胞經(jīng)NVP-BEZ235處理后，PI3K及mTOR通路得到了抑制。

卵巢癌是一種高轉(zhuǎn)移率和高復(fù)發(fā)率的疾病，復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移占卵巢癌患者死亡原因的90%。如何有效地抑制卵巢癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移，對延長卵巢癌病人的生存，改善生存質(zhì)量具有極其重要的意義[13]。PI3K-mTOR通路居于調(diào)控腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的核心位置。經(jīng)典的腫瘤分泌因子TGFβ通過激活PI3K-mTOR，引起腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)化而導(dǎo)致侵襲能力增強，抑制mTOR通路活性，從而能夠逆轉(zhuǎn)該過程，減少癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移[14]。有研究表明，在胰腺神經(jīng)分泌型腫瘤中，同時加入PI3K和mTOR抑制劑后，除腫瘤細(xì)胞增殖受到明顯抑制外，體內(nèi)外轉(zhuǎn)移能力也大大減弱[15]。本研究中，NVP-BEZ235在不影響卵巢癌增殖的濃度劑量下，Transwell實驗證明其顯著抑制了卵巢癌細(xì)胞的體外遷移能力。本文另一新穎之處為運用了斑馬魚移植瘤這一很好的體內(nèi)驗證模型，驗證了NVP-BEZ235的體內(nèi)抑制活性。實驗結(jié)果證明，該藥也有很好的抑制體內(nèi)轉(zhuǎn)移的功能。以上結(jié)果表明，NVP-BEZ235作為PI3K-mTOR通路抑制劑，不僅可以抑制卵巢癌的增殖，同時對于卵巢癌的轉(zhuǎn)移起到了很好的抑制作用，在治療卵巢癌方面有很好的應(yīng)用前景。

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