生物素化膽甾醇基普魯蘭糖合成及其自聚集性質(zhì)

楊文智，王苗苗，李海鷹，馬麗蘭，李霞霞

(河北大學(xué) 藥學(xué)院，河北 保定 071002)

高分子材料用作藥物的納米載體，可增大藥物溶解度，改善藥物生物利用度，達(dá)到緩釋或靶向作用，為腫瘤治療提供了一種新方法．近年來，文獻(xiàn)報道采用新型高分子材料制備載藥微球、脂質(zhì)體或納米粒，作為藥物的新型傳遞系統(tǒng)[1-3]．

普魯蘭糖是中性直鏈多糖，具有易溶、安全、無毒、生物相容與降解性好和多羥基易化學(xué)修飾等優(yōu)點，備受研究者關(guān)注[4]．接枝改性普魯蘭糖是其研究的熱點之一，文獻(xiàn)報道用聚酯[5]、?；鵞6]或聚乙二醇[7]等對多糖鏈進(jìn)行接枝改性，制備兩親性普魯蘭糖高分子材料，得到材料可在水中自聚集成納米粒，用于負(fù)載藥物和多肽，實現(xiàn)藥物的可控和靶向釋放．膽甾醇基普魯蘭糖(CHSP)是一種新型兩親性材料，其自聚集納米粒可負(fù)載抗腫瘤藥物或作為蛋白藥物分子伴侶，實現(xiàn)藥物的體外緩釋及被動靶向作用[8-11]．但其與組織或細(xì)胞缺少特異性結(jié)合，難以實現(xiàn)主動靶向．腫瘤組織生長需大量生物素，相比正常細(xì)胞，腫瘤細(xì)胞表面有大量生物素受體，導(dǎo)致其更易識別結(jié)合生物素．生物素化學(xué)鍵合納米載體可主動靶向傳遞抗瘤藥物[12]．文獻(xiàn)報道，生物素化納米顆粒與乳腺或?qū)m頸腫瘤細(xì)胞共孵育，腫瘤細(xì)胞攝取納米粒量優(yōu)于未接生物素的納米粒[13]．

基于以上原因，本文設(shè)計將生物素鍵合到CHSP材料上，獲得適宜取代度的生物素化膽甾醇基普魯蘭(Bio-CHSP)兩親性材料，希望獲得其自聚集納米粒，為下一步負(fù)載抗腫瘤藥物，實現(xiàn)生物素介導(dǎo)載藥納米粒的主動靶向作用提供實驗支持.

1 實驗材料

核磁共振儀(瑞士布魯克公司，型號：Bruker AVANCE Ⅲ 600)；X線粉末衍射儀(德國布魯克公司，型號：D8 Advance)；熒光分光光度計(上海精密科學(xué)儀器有限公司, 型號：970CRT)；動態(tài)激光粒度分析儀(美國貝克曼庫爾特公司，型號：Delsa Nano zeta)；氣浴恒溫振蕩器(金壇市醫(yī)療儀器廠，型號：THZ-82)；透射電鏡(日本電子株式會社, 型號：JEM-100C)；LCD探頭超聲儀(寧波新芝生物科技股份有限公司，型號：SCIENTZ JY 92-Ⅱ)．

膽甾醇基普魯蘭糖(CHSP)參考文獻(xiàn)[14]合成，膽甾醇的取代度為5.4%；生物素(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，上海)；1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺鹽酸鹽/EDC· HCL(Sigma Co. USA)；4-二甲氨基吡啶(DMAP， Sigma Co. USA)；芘(Aldrich Co. USA)；透析袋(截留相對分子質(zhì)量為8～14 ku，美國)；其余試劑均為分析純．

2 實驗方法

2.1 生物素化膽甾醇基普魯蘭糖(Bio-CHSP)材料的合成

2.1.1 材料合成方法

取膽甾醇基普魯蘭糖(CHSP)0.5 g和適量生物素溶于4 mL 二甲基亞砜(DMSO)中，加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亞胺(EDC· HCL)(n(EDC)/n(生物素)=1.2)，4-二甲氨基吡啶(DMAP)((n(DMAP) /n(生物素)=0.1)，45 ℃反應(yīng)5 d．反應(yīng)結(jié)束，反應(yīng)液滴入體積分?jǐn)?shù)95%乙醇中，抽濾，濾餅分別用二氯甲烷、稀堿液和無水乙醇洗滌，干燥，即得生物素化膽甾醇基普魯蘭糖，備用．材料的合成路線見圖1．

2.1.2 X線粉末衍射分析

生物素、CHSP、Bio-CHSP和生物素與CHSP的物理混合的干燥樣品在2θ為5～80°內(nèi)掃描樣品的X線粉末衍射圖譜．

2.1.3 氫核磁測定與材料生物素取代度確定

生物素、CHSP和Bio-CHSP樣品溶于DMSO-d6，置于AVANCE Ⅲ 600 MHz核磁共振儀中，測定樣品的氫核磁圖譜．采用1HNMR法測定生物素的取代度，計算每100個葡萄糖殘基上偶聯(lián)生物素個數(shù)．

2.2 Bio-CHSP 納米粒的制備及表征

透析法制備Bio-CHSP自組裝納米粒[7]．稱取不同取代度的Bio-CHSP材料適量溶于DMSO中，轉(zhuǎn)移到截留相對分子質(zhì)量8～14 ku的透析袋中，置于1 000 mL蒸餾水中透析9 h，透析完畢，定容，100 W探頭超聲2 min，即得自組裝納米粒，備用．將制得的自組裝納米粒溶液制樣，采用透射電鏡(TEM)觀察形態(tài)；利用動態(tài)激光粒度分析儀(DLS)測其粒徑分布及Zeta電勢．

2.3 臨界聚集濃度(CAC)的測定

取 10 mL容量瓶，加入適當(dāng)濃度的芘-甲醇溶液，氮氣吹干，分別加入精密配制的不同濃度的Bio-CHSP 納米溶液，使芘最終濃度為6×10-7mol/L，37 ℃恒溫振蕩1 h．熒光測定樣品，激發(fā)波長334 nm，發(fā)射光譜掃描300～500 nm，激發(fā)與發(fā)射狹縫寬度分別為5 nm和2 nm，記錄372 nm和383 nm處的熒光吸收強度(I)，以I372/I383對濃度ρ(mg/mL)的logρ作圖，計算CAC．

3 結(jié)果與討論

3.1 Bio-CHSP的合成與表征

Bio-CHSP衍生物的合成路線見圖1，EDC·HCl作為脫水劑和偶合劑，DMAP作為催化劑，通過酯化反應(yīng)將生物素連接于膽甾醇基普魯蘭多糖上，獲得Bio-CHSP．

圖1 Bio-CHSP合成路線Fig.1 Synthesis route of Bio-CHSP

圖2為生物素、CHSP和Bio-CHSP 的1HNMR譜．文獻(xiàn)報道CHSP氫核磁數(shù)據(jù)[14]：0.40～1.20(膽甾醇骨架氫)，2.49(DMSO-d6)，2.53(琥珀酰2個亞甲基峰，—OCH2CH2O—)，2.60～4.60(糖環(huán)上C2,C3,C4,C5,C6氫峰)，4.60(C1，1H，α-1,6)，5.05(C1，1H，α-1,4)，4.60～5.40(羥基吸收峰，—OH)． Bio-CHSP氫譜中除CHSP 的特征峰外，出現(xiàn)生物素特征峰，如：1.20～1.80(a, 6H, —(CH2)3—, m)，4.17(b, 1H, dd), 4.32(c, 1H, m) 和6.45(d, 2H, =N—H, brs)；由于生物素化學(xué)鍵合到CHSP糖鏈上，6.45脲(—NH—CO—NH—)吸收峰為寬單峰，明顯有別于單獨的生物素氫核磁峰．同時，Bio-CHSP氫譜上未見12.0處羧基峰(—COOH)[15]；這些氫核磁數(shù)據(jù)表明，生物素成功接枝到膽甾醇基普魯蘭多糖鏈上．

普魯蘭多糖由單糖通過α-1,4和α-1,6糖苷鍵連接而成． Bio-CHSP 氫譜的4.17(b, 1H, dd)和4.32(c, 1H, m)的“=CH—”核磁峰明顯且無干擾，故CHSP多糖鏈接枝生物素取代度可按如下公式(1)計算，A代表在某化學(xué)位移處峰面積，不同投料比合成Bio-CHSP材料的生物素取代度(DS)見表1．

×100. (1)

a生物素與CHSP投料物質(zhì)的量比；bDLS測定Bio-CHSP納米粒粒徑(Dh)及粒徑分布(PDI)；c熒光法測定不同取代度Bio-CHSP材料水中的臨界聚集濃度；dDLS測得水中自聚集Bio-CHSP 納米粒的(ζ)電勢.

A.生物素；B.CHSP；C.Bio-CHSP.圖2 氫核磁共振圖譜Fig.2 1HNMR spectra

A.生物素;B.CHSP;C.Bio-CHSP;D.a與b物理混合(質(zhì)量比1∶10).圖3 X衍射譜Fig.3 Xray diffraction patterns

生物素、CHSP、Bio-CHSP和生物素與CHSP混合樣品的X粉末衍射圖譜，見圖3．生物素在2θ為8.4，12.1，17.7，18.8，21.3，22.5，28.5，34.1°處顯示出尖銳特征峰，表明其為小分子結(jié)晶態(tài)．CHSP與Bio-CHSP材料均為非晶態(tài)，CHSP 在2θ為17.9°處具有寬衍射峰，而Bio-CHSP 寬衍射峰出現(xiàn)在18.7°處；生物素與CHSP物理混合樣品的圖譜中存在明顯尖銳的生物素特征峰．由上可知，生物素化學(xué)鍵合到CHSP多糖鏈上[16]．

1HNMR 與X線粉末衍射數(shù)據(jù)分析，證明生物素化膽甾醇基普魯蘭糖的合成．

3.2 透射電鏡及粒徑分析

具有適宜生物素取代度的Bio-CHSP可在水中自聚集形成納米凝膠，納米粒子呈圓形或橢圓形，結(jié)果見圖4．圖 4a是Bio-CHSP-2自組裝納米粒的透射電鏡圖．從圖中可以看出納米粒成球形，粒徑約為150 nm，分散比較均勻．不同生物素取代度的Bio-CHSP自聚集納米粒子的粒徑和Zeta電位見表1．Bio-CHSP自組裝納米粒在水中自聚集粒徑為100～180 nm．自聚集納米粒的粒徑與生物素取代度有關(guān)，取代度增大，粒徑變小，即疏水性強，利于Bio-CHSP自聚集納米粒形成更緊密的疏水核心，導(dǎo)致納米粒粒徑減?。瓺LS測得的自聚集納米粒粒徑較 TEM 觀察的粒徑大，粒徑分布見圖4b．透射電鏡測定的是自聚集納米粒干態(tài)粒徑，DLS測定自聚集納米粒水合粒徑，故同一樣品DLS測定粒徑偏大．Bio-CHSP自聚集納米粒Zeta 電位呈現(xiàn)負(fù)值．

a.透射電鏡照片；b.DLS粒徑分布.圖4 Bio-CHSP納米粒Fig.4 Bio-CHSP-2NPs

3.3 臨界聚集濃度(CAC)的測定

在溶液體系中，芘分子自發(fā)地由極性環(huán)境向非極性環(huán)境轉(zhuǎn)移，當(dāng)溶液體系的極性發(fā)生變化，即非極性環(huán)境變強，可使熒光檢測信號顯著增強.實驗選擇芘作為熒光探針，水溶液芘濃度低于10-5mol/L，其在372，379，383，390，397 nm處出現(xiàn)激發(fā)態(tài)熒光的5重發(fā)射峰，第1與第3發(fā)射峰強度比(I372/I383)常用作芘“極性標(biāo)尺”，反映芘所處環(huán)境的極性狀況．一般通過I372/I383的比值大小來推測溶液中膠束濃度的變化．利用此原理，可評價水中高分子膠束的疏水結(jié)構(gòu)域的生成狀況．親水普魯蘭糖長鏈化學(xué)鍵合疏水膽甾醇及生物素基團(tuán)，當(dāng)疏水基適宜取代，材料則顯雙親性質(zhì)．故本實驗采用芘為熒光探針，應(yīng)用穩(wěn)態(tài)熒光探針法，評價Bio-CHSP材料兩親性強弱，并測定其自聚集水凝膠納米粒的臨界聚集濃度(CAC)[17]．見圖5，將不同濃度的Bio-CHSP 膠束溶液下測定的I372/I383與logρ作圖，對曲線兩端線性擬合，其交點濃度即為Bio-CHSP自聚集納米粒的CAC值，結(jié)果見表1．接枝糖鏈的生物素增多，疏水作用力增強，Bio-CHSP易發(fā)生自聚集，表現(xiàn)為CAC值減小[18]．

■ Bio-CHSP-1； ●Bio-CHSP-2.圖5 Bio-CHSP 芘熒光發(fā)射光譜I372/I383與logρ之間的關(guān)系Fig.5 Intensity ratio (I372/I383) from excitation spectra of pyrene (6.0×10-7mol/L) with various concentrations of Bio-CHSP

4 結(jié)論

成功合成并表征了不同生物素取代的膽甾醇基普魯蘭糖衍生物，合成材料具備兩親性，可在水中自聚集成球形納米粒，獲得的Bio-CHSP材料納米粒用作抗瘤藥物載體及其生物學(xué)效應(yīng)評價正在實驗中．

參 考 文 獻(xiàn):

[1] JENOG Y I，NA H S，OH J S，et al．Adriamycin release from self-assembling nanospheres of poly(dl-lactide-co-glycolide)-grafted pullulan[J]．International Journal of Pharmaceutics，2006，322(1-2)：154-160．

[2] FUNDUEANU G，CONSTANTIN M，ASCENZI P．Preparation and characterization of pH-and temperature-sensitive pullulan microspheres for controlled release of drugs[J]．Biomaterials，2008，29(18)：2767-2775．

[3] SIVAKUMAR P A，PANDURANGA R K．The use of cholesteryl pullulan for the preparation of stable vincristine liposomes[J]．Carbohydrate Polymers，2003，51(3)：327-332．

[4] LEATHERS T D．Biotechnological production and applications of pullulan[J]．Appl Microbiol Biotechnol，2003，62(5-6)：468-473．

[5] FISCHER S，UETZ-VON ALLMEN E，WAECKERLE-MEN Y，et al．The preservation of phenotype and functionality of dendritic cells upon phagocytosis of polyelectrolyte-coated PLGA microparticles[J]．Biomaterials，2007，28(6)：994-1004．

[6] ZHANG Huizhu，GAO Fuping，LIU Lirong，et al．Pullulan acetate nanoparticles prepared by solvent diffusion method for epirubicin chemotherapy[J]．Colloids and Surfaces B: Biointerfaces，2009，71(1)：19-26．

[7] JUNG S W，JEONG Y I， KIM Y H，et al．Self-assembled polymeric nanoparticles of poly(ethylene glycol) grafted pullulan acetate as a novel drug carrier[J]．Arch Pharm Res，2004，27(5)：562-569．

[8] HIRAKURA T，YASUGI K，AKIYOSHI K，et al．Hybrid hyaluronan hydrogel encapsulating nanogel as a protein nanocarrier: New system for sustained delivery of protein with a chaperone-like function[J]．Journal of Controlled Release，2010，142(3)：483-489．

[9] SUNAMOTO J，USHIO K， LAI DT．Folate-modified cholesterol-bearing pullulan, a new cancer-targeted nanoparticle drug carrier: synthesis and applications[J]．J Bioact Compat Polym，2006，21(6)：603-617．

[10] TAO Xiaojun，ZHANG Qiufang，LING Kai，et al．Effect of pullulan nanoparticle surface charges on HSA complexation and drug release behavior of HSA-bound nanoparticles[J]．PLOS ONE，2012，7(11)：e49304．

[11] TAO Xiaojun，ZHANG Qiufang，YANG Wenzhi，et al．The interaction between human serum albumin and cholesterol-modified pullulan nanoparticle[J]．Current Nanoscience，2012，8(6)：830-837．

[12] NA K，LEE T，PARK K H，et al．Self-assembled nanoparticles of hydrophobically-modified polysaccharide bearing vitamin H as a targeted anti-cancer drug delivery system[J]．European Journal of Pharmaceutical Sciences，2003，18(2)：165-173．

[13] KIM S Y，CHO S H，LEE Y M，et al．Biotin-conjugated block copolymeric nanoparticles as tumor-targeted drug delivery systems[J]．Macromolecular Research，2007，15(7)：646-655．

[14] YANG Wenzhi，CHEN Hongli，GAO Fuping，et al．Self-aggregated nanoparticles of cholesterol-modified pullulan conjugate as a novel carrier of mitoxantronep[J]．Current Nanoscience，2010，6(3)：298-306．

[15] TONG Dajun，YAO Jia，LI Haoran，et al．Synthesis and characterization of thermo- and pH-sensitive block copolymers bearing a biotin group at the poly(ethylene oxide) chain end[J]．Journal of Applied Polymer Science，2006，102：3552-3558．

[16] JUNG S W，JENOG Y I， KIM S H．Characterization of hydrophobized pullulan with various hydrophobicities[J]．International Journal of Pharmaceutics，2003，254(2)：109-121．

[17] CHEN Mingmao，LIU Ran，YANG Wenzhi，et al．Preparation and characterization of self-assembled nanoparticles of 6-O-cholesterol-modified chitosan for drug delivery[J]．Carbohydrate Polymers，2011，84(4)：1244-1251．

[18] NA K，PARK K M，JO E，et al．Self-organized pullulan/deoxycholic acid nanogels: Physicochemical characterization and anti-cancer drug-releasing behavior[J]．Biotechnol Bioprocess Eng，2006，11(3)：262-267．