博落回生物堿對12種植物病原菌的抑制活性研究

高紅梅，付小草，何婷，李坡，劉霞，袁小紅，馬林

(西南科技大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，四川綿陽 621010)

博落回(Macleaya cordata)為罌粟科博落回屬多年生草本植物，全株可入藥，民間用于止咳、治療疥癬、療毒及殺蟲滅蛆等。博落回主要含血根堿、白屈菜紅堿、原阿片堿、博落回堿等多種異喹啉類生物堿成分，具有抗菌、殺蟲、抗腫瘤、改善肝臟功能等多種生物活性［1］。在抗菌作用方面，已有研究報(bào)道了博落回提取物或分離生物堿成分對感染人體的常見病原細(xì)菌及真菌具有不同程度的抑制作用［2－4］，對曲霉、青霉、根霉、毛霉等常見真菌也有較好的抑制作用［5］。此外，還有研究表明博落回對導(dǎo)致魚病及畜禽感染的病原細(xì)菌也具有抑制效應(yīng)［6－7］。

博落回對農(nóng)作物病原菌的抑制效應(yīng)已有少量報(bào)道，如劉浩等［8－12］采用不同方法研究了博落回提取物或分離成分對多種植物病原真菌的抑制作用，但對植物病原細(xì)菌的抑制作用研究極少［8－9］。為進(jìn)一步了解博落回生物堿的抑菌作用范圍，筆者研究了博落回生物總堿對4種植物病原細(xì)菌和8種植物病原真菌的離體抑制活性，以期為博落回生物堿的進(jìn)一步研究及應(yīng)用開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌種。細(xì)菌:水稻白葉枯病菌(Xanthomonas oryzae)、大白菜軟腐病菌(Erwinia carotovora)、柑橘潰瘍病菌(Xanthomonas campestris)、姜瘟病菌(Pseudomonas solanacarum)。真菌:小麥赤霉病菌(Fusarium graminearum)、油菜菌核病菌 (Sclerotinia sclerotiorum)、玉米小斑病菌(Helminthosporium maydis)、番茄綿腐病菌(Pythium aphanidermatum)、棉花枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.vasinfectum)、香蕉酸腐病菌(Geotrichum candidum Link ex Pers)、蘋果腐爛病菌(Valsa mali Miyabe et Yamade)和葡萄黑痘病菌［Elsinoe ampelina(de Bary)Shear］。上述供試細(xì)菌及真菌均由四川大學(xué)農(nóng)藥與作物保護(hù)研究所提供。

1.1.2 供試藥劑。博落回生物總堿由湖南漢清生物技術(shù)有限公司提供，主要含血根堿和白屈菜紅堿，總生物堿含量大于80%。

1.2 方法

1.2.1 供試藥液的配制。

1.2.1.1 博落回生物總堿供試液。博落回生物總堿粉末用1%氫氧化鈉溶解，按倍數(shù)稀釋法配制成濃度為1 000.00、500.00、250.00、125.00、62.50、31.25 和 15.63 μg/ml的供試液，置于4℃冰箱備用。

1.2.1.2 青霉素鈉溶液。將青霉素鈉用20%甲醇溶解配成500 μg/ml的母液，按倍數(shù)稀釋法配成濃度為 100.00、50.00、25.00、12.50、6.25 μg/ml的供試液，置于 4 ℃冰箱備用。

1.2.2 菌種活化。

1.2.2.1 細(xì)菌活化。采用液體牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基［13］。將冰箱保存的細(xì)菌菌種分別接1環(huán)于滅菌的液體蛋白胨牛肉膏培養(yǎng)基中，37℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18～24 h。

1.2.2.2 真菌活化。采用 PDA 液體培養(yǎng)基［13］。將冰箱保存的真菌菌種分別接種真菌菌餅(直徑6 mm)于滅菌的液體PDA培養(yǎng)基中，28℃恒溫振蕩培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18～24 h。

1.2.3 細(xì)菌抑制活性測定。

1.2.3.1 抑菌圈直徑的測定。采用牛津杯法。倒好瓊脂平板后，冷卻，吸取0.2 ml供試細(xì)菌菌懸液，均勻涂滿整個(gè)平板，靜置5 min后每板等距放入5個(gè)牛津杯，輕輕加壓使牛津杯和培養(yǎng)基無縫隙。3個(gè)牛津杯中加入0.2 ml博落回生物總堿供試液(濃度為1.00 mg/ml)，其余2個(gè)牛津杯中分別加入等量的2%甲醇溶液和0.50 mg/ml青霉素鈉溶液，分別作為陰性對照和陽性對照。每一菌種3次重復(fù)。于37℃培養(yǎng)48 h后測定抑菌圈直徑。

1.2.3.2 最低抑菌濃度(MIC)的測定。采用瓊脂打孔法。吸取1 ml細(xì)菌菌懸液于培養(yǎng)皿中，加入24.0 ml牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基(45～50℃)，使菌液與培養(yǎng)基充分混勻，靜置冷卻。用直徑6 mm的打孔器打孔，分別加入博落回生物總堿的不同濃度供試液100 μl。于37℃培養(yǎng)48 h后觀察抑菌情況，以抑菌圈直徑≥7 mm的供試液最低濃度作為MIC。青霉素鈉陽性對照采用相同方法測定其MIC。

1.2.4 真菌抑制活性測定。

1.2.4.1 抑菌圈直徑的測定。采用牛津杯法。倒好平板并冷卻后，吸取0.2 ml供試真菌菌懸液均勻涂布整個(gè)平板，靜置5 min后每板等距放入3個(gè)牛津杯，輕輕加壓使牛津杯和培養(yǎng)基無縫隙。每個(gè)牛津杯加入0.2 ml博落回生物總堿供試液(濃度為1.00 mg/ml)。每一菌種3次重復(fù)。于28℃培養(yǎng)48 h后測定抑菌圈大小。

1.2.4.2 MIC的測定。采用瓊脂打孔法。吸取1 ml真菌菌懸液于PDA培養(yǎng)皿中，加入24.0 ml培養(yǎng)基(45～50℃)，使菌液與培養(yǎng)基充分混勻，靜置冷卻。用直徑6 mm的打孔器打孔，分別加入博落回生物總堿的不同濃度供試液100 μl。于28℃培養(yǎng)48 h后觀察抑菌情況，以抑菌圈直徑≥7 mm的供試液最低濃度作為MIC。

1.2.5 數(shù)據(jù)處理。抑菌圈直徑采用Excel軟件計(jì)算平均值及標(biāo)準(zhǔn)誤。顯著性差異分析采用DPS7.5軟件，按最小顯著差異法(LSD)進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 博落回生物總堿對4種植物病原細(xì)菌的抑制效應(yīng) 由表1可知，在濃度為1.00 mg/ml時(shí)，博落回生物總堿對水稻白葉枯病菌、大白菜軟腐病菌、柑橘潰瘍病菌及姜瘟病菌的抑菌圈直徑均超過30 mm，但在4個(gè)植物病原細(xì)菌間無顯著差異。青霉素鈉陽性對照對水稻白葉枯病菌的抑制效果最好，其次為姜瘟病菌，而對大白菜軟腐病菌和柑橘潰瘍病菌的抑制效果相對較弱。

最低抑菌濃度測定結(jié)果表明(表2)，博落回生物總堿對水稻白葉枯病菌和姜瘟病菌的抑制效果較好，MIC均為31.25 μg/ml，對大白菜軟腐病菌和柑橘潰瘍病菌的MIC為62.50 μg/ml。青霉素鈉陽性對照對水稻白葉枯病菌、大白菜軟腐病菌和姜瘟病菌的MIC為12.50 μg/ml，對柑橘潰瘍病菌的 MIC 為 25.00 μg/ml。

表1 博落回生物總堿對植物病原細(xì)菌的抑制效果

表2 博落回生物總堿對植物病原細(xì)菌的最低抑菌濃度

2.2 博落回生物總堿對植物病原真菌的抑制效應(yīng) 由表3可知，博落回生物總堿對8種植物病原真菌均有較好的抑制作用。在供試液濃度為1.00 mg/ml時(shí)，博落回生物總堿對不同菌種的抑制效果存在一定差異，棉花枯萎病菌、小麥赤霉病菌、玉米小斑病菌和蘋果腐爛病菌最敏感，抑菌圈直徑均在16 mm以上，其次是油菜菌核病菌，抑菌圈直徑為14.9 mm，對葡萄黑痘病菌、番茄綿腐病菌和香蕉酸腐病菌的抑制相對較弱。

除蘋果腐爛病菌外，博落回生物總堿對7個(gè)供試真菌的最低抑菌濃度與抑菌圈直徑測定結(jié)果基本吻合，抑制效應(yīng)較好的真菌包括棉花枯萎病菌、小麥赤霉病菌、玉米小斑病菌和油菜菌核病菌(MIC值均為125.00 μg/ml)。

表3 博落回生物總堿對植物病原真菌的抑制作用

3 討論

試驗(yàn)結(jié)果表明，博落回生物總堿對水稻白葉枯病菌、大白菜軟腐病菌、柑橘潰瘍病菌和姜瘟病菌具有較好的抑制作用，供試液濃度在1.00 mg/ml時(shí)抑菌圈直徑均在30 mm以上;MIC 測定結(jié)果(31.25 ～62.50 μg/ml)也表明博落回生物總堿具有較好的抑制效應(yīng)。劉浩等采用博落回全株酸水提取物進(jìn)行抑菌活性測定，發(fā)現(xiàn)在50.00 mg/ml濃度時(shí)對黃瓜細(xì)菌性角斑病菌和辣椒瘡痂病菌的抑菌圈直徑分別為11.3和12.3 mm［9］，他們進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，主要是博落回生物堿中的血根堿及白屈菜紅堿發(fā)揮了抑菌作用(MIC為16.00～32.00 μg/ml)［8］。雖然到目前為止，有關(guān)博落回對植物病原細(xì)菌抑制效應(yīng)的研究報(bào)道較少，但該研究結(jié)果進(jìn)一步表明博落回可能在抑制植物病原細(xì)菌方面具有較大潛力。

博落回生物總堿對真菌的抑菌效果也較好，在1.00 mg/ml濃度時(shí)抑菌圈直徑為12.8～17.5 mm，特別是對棉花枯萎病菌、小麥赤霉病菌、玉米小斑病菌和蘋果腐爛病菌的抑制效應(yīng)更明顯，抑菌圈直徑均大于16 mm。對應(yīng)MIC測定結(jié)果與抑菌圈直徑大小，除蘋果腐爛病菌和小麥赤霉病菌外，其余結(jié)果在二者間均基本吻合。胡美忠等研究了博落回生物總堿對煙草黑脛病菌的抑制效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)在320.00 μg/ml濃度時(shí)的抑制率為77.4%［11］。胡喬木等采用菌絲生長速率法研究發(fā)現(xiàn)博落回粗提物對小麥赤霉病菌的抑制率超過80%［12］。劉浩等研究表明，博落回全株酸水提取物在2.00 mg/ml濃度時(shí)對棉花枯萎病菌、黃瓜枯萎病菌、番茄枯萎病菌、番茄早疫病菌、水稻紋枯病菌和禾谷絲核菌的抑制率為70.0% ～80.0%［9］。還有研究發(fā)現(xiàn)博落回地上部水提液對大蔥紫斑病菌也有較好的抑制效果(抑制率為68.3%)［10］。此外，對博落回提取物中的分離成分如血根堿、白屈菜紅堿、原阿片堿和別隱品堿等進(jìn)行抑制真菌活性研究，也發(fā)現(xiàn)對輪紋病菌、葡萄灰霉病菌、禾谷鐮刀病菌、稻瘟病菌、水稻紋枯病菌及煙草黑脛病菌等具有較好的抑制效應(yīng)［8，11］。

該研究所采用的8個(gè)菌種中，除棉花枯萎病菌和小麥赤霉病菌外，其余6個(gè)菌種均未見有應(yīng)用于博落回抑菌效應(yīng)的研究。該研究結(jié)果表明，博落回在抑制真菌方面可能具有較大的作用范圍，值得進(jìn)行深入研究和應(yīng)用開發(fā)。

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