微藻培養(yǎng)條件優(yōu)化研究

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(黑龍江省能源環(huán)境研究院,哈爾濱 150027)

0 引 言

隨著人們生活水平的提高，對能源的消耗日益增加。據(jù)環(huán)保組織世界自然基金會(WWF)與可再生能源咨詢公司Ecofys的預測，在2050年，全球的能源消耗量將達到現(xiàn)今的兩倍。在化石能源消耗殆盡的情況下，人們紛紛把目光投向了生物能源。前段時間GCEP的報告稱生物能源在總體新能源中占大概20%的比重，僅次于太陽能。生物能源中的微藻柴油也正因此再次得到了人們的重視。

生物能源是解決能源問題的關鍵。它是清潔能源的代表，不但有極好的可循環(huán)性，并且環(huán)境友好，綠色清潔，是21世紀初各國能源部門都十分關注的領域。生物能源的開發(fā)、利用將有效的為社會發(fā)展提供動力，并且?guī)悠渌嚓P產(chǎn)業(yè)，如運輸、發(fā)電、以及相關的制造業(yè)。生物能源的發(fā)展在即將來臨的能源革命中將會起到至關重要的作用。而微藻生物柴油就是生物能源領域中很有前景的一個重要方向[1-2]。

1 實驗材料

1.1 菌 種

微藻(Chlorella Protothecoides), 從中國科學院典型培養(yǎng)物保藏委員會淡水藻種庫購得。

1.2 試劑與儀器設備

實驗室中所用的培養(yǎng)皿為250～500 mL三角燒瓶，其中瓶塞經(jīng)過特殊處理可以用來進行被動氣體交換。

培養(yǎng)基為BG(Blue-Green Medium)培養(yǎng)基,見表1。

表1 BG培養(yǎng)基

儀器和設備見表2。

表2 儀器和設備列表

2 小球藻的實驗方法

2.1 小球藻的富集培養(yǎng)

小球藻的富集工作是為了培養(yǎng)后續(xù)油脂累積實驗所需要的藻源。按照實驗需求分為光照培養(yǎng)箱培養(yǎng)和異養(yǎng)無光照培養(yǎng)兩種形式。在光照培養(yǎng)箱中的光暗周期為15 h∶9 h,每天早晚需將燒瓶搖勻。暗培養(yǎng)箱則不需要任何的光照。為了防止各類細菌污染，培養(yǎng)用工具器皿都要進過高溫滅菌。定期用顯微鏡觀察藻種情況，確定生長狀況以及是否存在污染。藻種的重新接種是為了保持藻種的新鮮程度，為油脂累積試驗提供固定的年輕藻源。接種時通過測量吸光度和血球計數(shù)板確定接種密度，一般使用吸光度在1～2范圍內的對數(shù)后期藻源接種。

2.2 油脂積累試驗

在油脂累積實驗中，不同的培養(yǎng)條件有不同的操作參數(shù)。實驗中所用的培養(yǎng)基仍為BG培養(yǎng)基，培養(yǎng)基的配置標準嚴格遵循武漢水生所淡水藻庫所提供的配方。在變化碳源和氮源的試驗中，培養(yǎng)基中所加入的配方比例經(jīng)過嚴格的計算后改動。由于考慮到土壤提取液中的碳氮含量，在設計氮源濃度，種類，碳氮比，限氮等試驗中不添加土壤提取液，以避免帶入不必要的干擾因素。

同時，通過加入1N HCl或1N NaOH 溶液的方式來調節(jié)pH值,使得試驗中的培養(yǎng)液pH濃度在5～10之間。溫度范圍則設定在10～45 ℃之間。光照強度的設定范圍從0lux到5 000 lux。油脂累積實驗中所用到的氮源有硫酸銨，硫酸鈉和酵母這三種，而碳源則有葡萄糖，乙酸鈉，混合碳源和模擬廢碳源這幾類。

2.3 小球藻生物量及油脂測定方法

微藻的生物量測定與含油量的測定是試驗的關鍵。試驗中對各個細節(jié)的掌握和熟練的操作可以確保數(shù)據(jù)的精確。因此在試驗進行之前，本課題組所有參加試驗的同學均經(jīng)過熟練的操作，經(jīng)過肯定后才可以參與處理核心試驗的測量。

2.3.1 小球藻生物量的采收

試驗中采用了離心法采收小球藻，將生長到研究需要階段的藻液轉移到離心管中，放入離心機，在4 000 rpm的轉速下離心5 min，放棄上清液，將下層濃縮藻泥放入冰箱冷凍30 min后轉入冷凍干燥機中干燥24 h。取出后保存在4 ℃的冰箱中備用。

2.3.2 小球藻生物量的測定方法

生物量的測定主要通過使用分光光度計的濁度法和顯微鏡下血球計數(shù)板的方法來確定生物量，并且配合稱重和吸光度值尋找最佳的生長量擬合曲線。

2.3.3 細胞干重法

取4 mL 藻液置于已稱重的5 mL離心管中，在5 000～7 000 rpm轉速下離心5 min，去上清液。并放于烘干箱中在65 ℃下烘干至恒重。同時測量三個平行樣，取平均值。

2.3.4 濁度法

使用紫外可見分光光度儀測量微藻溶液在波長為540 nm下的吸光度(OD540)。用去離子水作為參比樣測量在540 nm時的吸光度。通過每天測得的吸光度繪制小球藻的生長曲線。并對小球藻的生長情況做出分析。

2.3.5 生長曲線的確定

生長曲線是將微藻溶液吸光度和干重相結合所得到的描述單一批次微藻生長狀況的線。通過生長曲線我們可從吸光度的大小直接聯(lián)系到藻液中含有藻量的干重，便于試驗的進展。

細胞干重的測量方法是生物量計算的最直接方法，但是由于過程中需要涉及到離心，洗滌和干燥幾個步驟，不然消耗很長的時間動起手來也比較繁瑣。因為細胞濃度與干重之間存在著較好的正相關關系，所以我們可以建立一套標準曲線或者回歸方程，通過對吸光度的測量間接得到樣品中生物量的大小。這種計算方法也正是大多數(shù)的單細胞小球藻研究中所慣用的手段[3-5]。

在BG培養(yǎng)基、pH值自然狀態(tài)、光照強度2 000 lux、接種量1∶5、培養(yǎng)溫度25 ℃的條件下培養(yǎng)，得到如圖1所示的生長曲線。

圖1 小球藻生長曲線

2.4 小球藻油脂的提取

研究中所使用的優(yōu)質提取技術是浸提法。溶劑浸提的方法是提取油脂的一種傳統(tǒng)方法，現(xiàn)實生活中比較常見。因為脂類不溶于水，卻易溶于有機溶劑，測定脂類多時候采用沸點較低的有機溶劑萃取的方式。根據(jù)相似相容的規(guī)律，非極性的油脂要用非極性的溶劑，極性的糖脂要用極性的醇類來提取。我們的研究中所采用的方法是正己烷和異丙醇向結合的提取方式，每4g干重的微藻需要300 mL的提取液，其中正己烷和異丙醇的體積比例為3∶2。為了做到?jīng)]有氣體揮發(fā)，提取用錐形瓶的瓶口需要用鋁箔紙密封。并且在800 rpm的轉速下反應8 h。細胞殘留物在通過Whatman GF/C 濾紙時被去除。濾液被轉入分液漏斗并加入40 mL水作為誘導兩相穩(wěn)定的引導。當混合溶劑分離出兩個不同的層面時，上層深綠色的正己烷層包含有被提取的油脂；下層淺綠色水醇混合層包含有非油脂類藻細胞雜質。正己烷層的液體將被移入到一個事先稱量過的容器中，并在干燥箱內以60 ℃的溫度蒸發(fā)。蒸發(fā)使得脂肪類重量量化烘干。最終的油脂通過重新稱重獲得。提取后的油脂可以溶解在20 mL的正己烷溶液中在4 ℃的條件下封存半個月備用。

3 結果與分析

環(huán)境因素是影響藻類生長和代謝的主要因素之一。在不同的環(huán)境條件影響下，一種藻的生長狀態(tài)和內部能量變化都產(chǎn)生微妙的變化[6-7]。在掌握了環(huán)境因素對藻類培養(yǎng)的影響后，即可以做到在實驗時排除不必要的影響因子，使得實驗的關鍵因素可以更加準確，穩(wěn)定。實驗中各變量是在其他相關量確定的基礎上進行調整。以此來尋找到一個最佳的試驗條件。同時，為了提高數(shù)據(jù)可靠性與準確性，實驗中的各項數(shù)據(jù)均為與平行樣的平均值。

3.1 培養(yǎng)溫度

單細胞藻類在光合作用的過程中，需要一定的溫度范圍。溫度的變化例如升溫或者降溫的時候會對光合作用有一定的促進或者抑制作用。有研究指出光合作用和呼吸作用的強度都會被溫度所影響，而這兩大支柱卻都是和微藻的生長代謝有著緊密的關系。并且微藻屬于生態(tài)熱型微生物，它們必須從環(huán)境中得到熱源，溫度的大幅度變化會導致生長速率，新陳代謝效率和細胞內的生化反應速度[8]。因此培養(yǎng)時的溫度是影響單細胞微藻生長的重要因素之一。微藻可以適應的溫度往往在15～40 ℃之間。而且不同種類的微藻所適應的范圍也有所不同。單細胞的綠藻小球藻最適合的溫度上限在36 ℃左右而最合適的溫度應在25～32 ℃之間。

所以這組實驗的目的是在確定的無光培養(yǎng)狀態(tài)下，在其他因素穩(wěn)定的條件里，尋找到最節(jié)能而且效率最高的的培養(yǎng)溫度。實驗中的溫度變化分為20、 25、30、32 ℃幾個標準。光照為0lux；初始pH為6.8；搖速為160 rpm；通氣量為50 mL/d；培養(yǎng)基為BG培養(yǎng)基；葡萄糖碳源濃度為1 g/L，培養(yǎng)72 h。

實驗結果見表3。

表3 不同培養(yǎng)溫度

通過上表3所示，可以看出當培養(yǎng)溫度在27.5和30 ℃時，吸光度(540 nm)相同且最大，也就是藻體濃度最大，所以微藻最適生長溫度為27.5 ℃。

3.2 初始pH

培養(yǎng)基中的初始pH值會影響微藻生長及新陳代謝等很多生化反應的一個重要因素，pH會干涉光合作用里二氧化碳的使用性，同時在呼吸作用中將會影響微藻利用有機碳源效率。并且因為pH可以影響細胞壁的滲透性能，從而會使得細胞對培養(yǎng)液中的營養(yǎng)離子的吸收和利用受到一定的影響。同時新陳代謝的中間產(chǎn)物的重復利用和藻內毒性也會有一定影響。與溫度和光照相同，最適合藻類生長的pH在不同藻種間各有不同。有研究指出[9]，最適合微藻生長的pH在5到8之間，pH7是最合適的。還有研究指出[10]，因為生長過程中微藻會因為二氧化碳的吸收使pH升高，所以最佳的初始pH應該為6左右。所以我們的研究將在pH5到10這個范圍中考察C. protothecoides 3的生長情況和油脂累積效果。

所以本實驗的目的是尋找到一個最適合C.protothecoides 3生長和油脂累積的pH值。實驗中的pH變化分為5.5、6.5、7.5、8.5幾個標準。光照為0lux；溫度為25 ℃；搖速為160 rpm；通氣量為50 mL/d；培養(yǎng)基為BG培養(yǎng)基；葡萄糖碳源濃度為1 g/L，接種量1∶5，培養(yǎng)72 h。實驗結果見表4。

表4 微藻不同初始pH值條件下的生長情況

通過上表4所示，可以看出當初始pH值在5.5時，吸光度(540 nm)最大，也就是藻體濃度最大，所以微藻最適生長的初始pH值為5.5。

3.3 接種量

初始接種影響藻種的繁殖速度，在BG培養(yǎng)基、初始pH自然狀態(tài)、光照強度0lux、培養(yǎng)溫度25 ℃的條件下培養(yǎng)時間72 h。

實驗結果見表5。

表5 微藻在不同接種量的情況下的生長情況

通過上表所示，可以看出當接種量在1∶5時，吸光度(540 nm)最大，也就是藻體濃度最大，所以微藻最適生長的接種量為1∶5。

3.4 有機碳源

有機碳源是一切生物生長的必須能源，所以有機碳源的濃度對藻種生長速率有重要的影響，在BG培養(yǎng)基、pH值自然狀態(tài)、光照強度0lux、接種量1∶5、培養(yǎng)溫度25 ℃的條件下培養(yǎng)時間72 h。

實驗結果見表6。

表6 微藻在不同培養(yǎng)基條件下的生長情況

通過表6所示，可以看出當培養(yǎng)基為BG+2 g/LC6H12O6時，吸光度(540 nm)最大，也就是藻體濃度最大，所以微藻最適生長的培養(yǎng)基為BG+2 g/LC6H12O6。

4 總 結

綜上所述，本實驗研究表明合理的碳氮比對微藻的生長有很大的影響。在其他條件不變的情況下，可以發(fā)現(xiàn)隨著有機碳的增加微藻的生物量也在增加，但當?shù)竭_一定生物量后，即使有機碳的量增加，生物量也不再有變化了。同時也看出在沒有有機碳存在的條件下培養(yǎng)，微藻生物量明顯比有機碳存在的條件下培養(yǎng)的生物量小。實驗研究表明微藻最適生長條件為接種量1∶5、初始pH值5.5、培養(yǎng)溫度27.5 ℃和BG+2 g/LC6H12O6培養(yǎng)基。

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