加味導(dǎo)赤散與維生素B12聯(lián)合灌胃對大鼠復(fù)發(fā)性口腔潰瘍模型外周血T淋巴細(xì)胞亞群的影響

李 婧，武云霞，管翠強(qiáng)，郭洪波(山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院口腔科，太原 03000;山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院中醫(yī)科;通訊作者，E-mail:383455695@63.com)

復(fù)發(fā)性阿弗他潰瘍(recurrent aphthous ulcer，RAU)又稱為復(fù)發(fā)性口腔潰瘍(recurrent oral ulcers，ROU)，是口腔科最常見的黏膜疾病之一。普通人群中發(fā)病率可高達(dá)20%，居口腔黏膜病之首。該病反復(fù)發(fā)作、具有明顯灼痛感，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量［1］，由于其致病機(jī)制不明且影響因素頗多，故目前沒有針對性治療的有效藥物。西醫(yī)藥效局限，毒副作用明顯，不宜長期使用。中藥治療口腔潰瘍的方法可謂多元化，注重全身治療與局部治療相結(jié)合，尋找一種效果顯著、副作用低、價格低廉、易于制劑的中藥是目前的研究方向之一。近年來研究表明ROU屬于一種自身免疫性疾病。實驗證明，T淋巴細(xì)胞亞群的數(shù)量和功能異?？梢砸饾儾“l(fā)生［2］。提示患者RAU的發(fā)生與細(xì)胞免疫功能下降和T淋巴細(xì)胞亞群失衡可能具有一定的相關(guān)性。Ujevic等提出葉酸和維生素B缺乏是復(fù)發(fā)性口腔潰瘍的誘因，補(bǔ)充維生素可預(yù)防口腔潰瘍的發(fā)生［3］。本課題目的是建立復(fù)發(fā)性口腔潰瘍模型，并觀察加味導(dǎo)赤散與維生素B12對模型大鼠外周血淋巴細(xì)胞亞群的影響，以探索其對ROU模型免疫功能的調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 材料

完全弗氏佐劑，美國Sigma公司。anti-CD4+-FITC和anti-CD8+-FITC由大連泛邦化工技術(shù)開發(fā)有限公司提供。維生素B12片，山西利豐華瑞制藥有限責(zé)任公司。左旋咪唑片，廣州白云山光華制藥股份有限公司。流式細(xì)胞儀，山西醫(yī)科大學(xué)實驗中心。組織勻漿器，武漢博士德生物有限公司提供。恒溫水浴箱，北京醫(yī)療設(shè)備廠。

1.2 動物分組

清潔級 Sprague-Dawley(SD)大鼠44只，體重180-200 g，雌雄各半，12只脫頸處死取黏膜備用。32只隨機(jī)分為正常組、潰瘍組、左旋咪唑組、加味導(dǎo)赤散+維生素B12組，每組8只。

1.3 中藥制備

加味導(dǎo)赤散:竹葉15 g、生地黃10 g、通草10 g、生甘草6 g、生石膏30 g。由山西醫(yī)科大學(xué)第一臨床醫(yī)院中藥房熬制，并分裝滅菌，4℃冰箱備用。灌胃前，50-60℃恒溫水浴下濃縮為生藥濃度為1 g/ml藥液，按人鼠等效劑量換算，大鼠用量為1.278 g/200 g，即以 1.278 ml/200 g，每天一次灌胃。

1.4 SD大鼠ROU模型建立

1.4.1 抗原乳化液的制備 12只大鼠脫頸處死，無菌條件下剝?nèi)】谇火つそM織，冰浴下組織勻漿器勻漿，加入0.1 mol/L，pH 7.4的 PBS緩沖液。 -70℃冰箱備用。每次免疫動物時，加入等量完全弗氏佐劑，制備成抗原乳化液。

1.4.2 ROU模型的建立 24只 SD大鼠(除8只正常組)脊柱兩側(cè)皮內(nèi)共注射2-3點抗原乳化液，每隔2周一次，共注射5次。在第三次注射抗原乳化液后一周所有模型組大鼠均出現(xiàn)口腔潰瘍。模型建立參考程茜等［4］造模方法。

1.5 給藥方法

第三次注射抗原乳化液后一周，左旋咪唑片按20 mg/kg灌胃;維生素 B12按20 μg/kg和加味導(dǎo)赤散一起灌胃，1次/d，連續(xù)20 d。治療完成后分別從各組大鼠眼眶取血，流式細(xì)胞儀檢測大鼠外周血CD4+、CD8+細(xì)胞數(shù)量以及 CD4+/CD8+。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組潰瘍組織變化

大鼠在第3次注射抗原一周后均出現(xiàn)口腔潰瘍。多發(fā)生在上下唇，圓形或橢圓形，邊緣較整齊，黃白色偽膜覆蓋。直徑約2-5 mm，3-5 d愈合，后又復(fù)發(fā)。灌胃20 d后HE染色光鏡觀察:模型組中上皮溶解破潰，淋巴細(xì)胞浸潤，固有層內(nèi)大量中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞及單核細(xì)胞浸潤，毛細(xì)血管充血擴(kuò)張。左旋咪唑組和加味導(dǎo)赤散+維生素B12組的潰瘍組織上皮及固有層內(nèi)炎癥細(xì)胞數(shù)量比模型組有所減少(圖1，見第668頁)。

2.2 流式細(xì)胞儀CD4+、CD8+的檢測結(jié)果

與正常組相比，潰瘍形成后CD4+細(xì)胞數(shù)量、CD4+/CD8+較正常對照組均降低，具有統(tǒng)計學(xué)差異(P＜0.05);CD8+細(xì)胞數(shù)與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。左旋咪唑組與加味導(dǎo)赤散+維生素B12組CD4+、CD4+/CD8+與模型組相比均有回升，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，兩用藥組之間差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05，見表1)。

表1 各組實驗大鼠外周血中T細(xì)胞亞群的變化(±s)Table 1 Changes of peripheral blood T-lymphocyte subsets in rats with ROU(±s)

表1 各組實驗大鼠外周血中T細(xì)胞亞群的變化(±s)Table 1 Changes of peripheral blood T-lymphocyte subsets in rats with ROU(±s)

與正常組比較，△P ＜0.05;與潰瘍組比較，*P ＜0.05

組別 n CD4+/% CD8+/% CD4+/CD8+正常組844.65 ±1.75 20.21 ±2.23 2.21 ±0.12潰瘍組 8 35.28 ±2.37△ 21.76 ±1.38 1.68 ±0.32△左旋咪唑組 8 40.24 ±2.28* 22.87 ±1.42 1.77 ±0.14*加味導(dǎo)赤散 +維生素 B12組 8 43.54 ±3.71* 20.13 ±2.35 2.15 ±0.25*

3 討論

近代研究表明，ROU屬于一種自身免疫性疾?。?］。黃華峰等檢測了同一ROU患者在潰瘍期和潰瘍緩解期外周血T細(xì)胞亞群的變化，并與正常人進(jìn)行了比較，表明在潰瘍期患者T細(xì)胞亞群分布與正常人有一定差別［5］。近年來，大量實驗研究皆證實了ROU患者外周血有不同程度的CD4+細(xì)胞數(shù)量下降及 CD4+/CD8+比值下降［6，7］，與本實驗研究一致。提示ROU患者機(jī)體免疫功能的異常改變之一是T細(xì)胞亞群的平衡失調(diào)。

淋巴細(xì)胞是構(gòu)成機(jī)體免疫系統(tǒng)的主要細(xì)胞群體，其中T淋巴細(xì)胞在機(jī)體防御初期起著非常重要的作用，T細(xì)胞有多個亞群，其中CD4+為T輔助—誘導(dǎo)亞群，CD8+為T殺傷—抑制亞群，兩者共同對免疫應(yīng)答進(jìn)行調(diào)節(jié)，CD4+功能之一是可誘導(dǎo)CD8+T淋巴細(xì)胞抑制免疫球蛋白G的合成和特異性抗體產(chǎn)生，所以CD4+細(xì)胞的減少可能導(dǎo)致患者對致病物敏感性提高以及非正常的自身免疫反應(yīng)。［8］

復(fù)發(fā)性口腔潰瘍在中醫(yī)學(xué)里稱“口瘡”“口瘍”“赤口瘡”等。中醫(yī)認(rèn)為本病主要由心經(jīng)熱盛，且心熱移至小腸所致。導(dǎo)赤散出自宋代錢乙的《小兒藥證直訣》，由生地、木通(關(guān)木通)、甘草、淡竹葉組成，為體現(xiàn)清熱利水養(yǎng)陰治法的基礎(chǔ)方?！夺t(yī)方考》上記載:“是方也，生地黃可以涼心，甘草梢可以瀉熱;佐之以木通，則直走小腸、膀胱矣。名曰導(dǎo)赤者，導(dǎo)其丙丁之赤，由溺而泄也”。中醫(yī)可根據(jù)四診八綱，通過加減味辨證施治。本實驗加味導(dǎo)赤散是以通草易關(guān)木通再加生石膏而成，配伍嚴(yán)謹(jǐn)，既延續(xù)了導(dǎo)赤散利水而不傷陰之精髓，又增加了其清熱瀉火之力。且現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究認(rèn)為，導(dǎo)赤散中生甘草有抗炎、調(diào)節(jié)免疫的作用［9］;竹葉具有擴(kuò)張毛細(xì)血管、疏通微循環(huán)等功效［10］;且竹葉，生地含有鉀、鎂、錳、鋅等多種微量元素［11，12］。通草和石膏中含有的鋅等微量元素也與 ROU 密切相關(guān)［13，14］。維生素 B12對口腔潰瘍病損有修復(fù)、加速新生組織生長和調(diào)節(jié)免疫的作用［15，16］。各種藥物相合，既能清熱涼血，而又利水通淋，臨床上亦起到促進(jìn)潰瘍愈合、提高口腔黏膜局部免疫功能、延緩復(fù)發(fā)的作用。

本實驗以左旋咪唑組作為陽性對照組，用藥后左旋咪唑組和加味導(dǎo)赤散+維生素B12組CD4+細(xì)胞數(shù)量和CD4+/CD8+比值均升高，與健康對照組接近，說明加味導(dǎo)赤散+維生素B12，可有效改善大鼠ROU模型T淋巴細(xì)胞亞群失衡，糾正免疫功能紊亂，由此推斷加味導(dǎo)赤散加維生素B12對復(fù)發(fā)性口腔潰瘍模型有治療作用，對于未來治療口腔潰瘍有一定的應(yīng)用前景。

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