貓傳染性鼻-結(jié)膜炎疫苗研究進(jìn)展

趙艷麗，董宏偉，2，陳小慶，劉秋艷，胡桂學(xué)

（1.吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，吉林 長(zhǎng)春130118；2.吉林省農(nóng)業(yè)廣播電視學(xué)校，吉林 長(zhǎng)春130021）

貓杯狀病毒（feline calicivirus，F(xiàn)CV）能引起貓的多發(fā)性口腔和呼吸道傳染病，還可引起結(jié)膜炎，故又稱為貓傳染性鼻-結(jié)膜炎病毒。FCV 是杯狀病毒科皰疹病毒屬（Vesivirus）的成員之一，其基因組為單股正鏈RNA，無(wú)囊膜，核衣殼呈二十面體對(duì)稱。

目前FCV 感染已呈世界性分布。幾乎所有的貓科動(dòng)物均易感，一歲以下的貓最易感，也有感染狗的報(bào)道。FCV 感染貓通常僅局限于口腔和上呼吸道，有些毒株還可以引發(fā)機(jī)體產(chǎn)生慢性胃腸炎和急性關(guān)節(jié)炎癥狀。FCV 在貓群中高度流行，主要是因?yàn)樵S多臨床康復(fù)的貓仍然是病毒攜帶者。該病雖發(fā)病率較高，但死亡率較低。然而病毒變異產(chǎn)生的強(qiáng)毒株可以引起嚴(yán)重的急性致死全身性疾?。╲irulent systemic disease，VSD）及出血熱樣疾病的暴發(fā)，致使貓死亡率增加。

目前貓傳染性鼻-結(jié)膜炎尚沒(méi)有特效的治療方法，疫苗免疫接種是防制該病的主要措施。傳統(tǒng)疫苗在病毒防制過(guò)程中起到重要的作用，但是這些疫苗只能減少臨床發(fā)病率和病毒的排出，可能無(wú)法防止感染。隨著分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)的發(fā)展，新型疫苗的研究也不斷被嘗試。本文對(duì)國(guó)內(nèi)外有關(guān)該病疫苗的研究進(jìn)展綜述如下。

1 傳統(tǒng)疫苗

1.1 滅活疫苗 該類疫苗優(yōu)點(diǎn)是安全性好，能夠減少由FCV 引起的臨床癥狀，缺點(diǎn)是不能誘導(dǎo)有效的黏膜免疫和細(xì)胞免疫應(yīng)答，因而無(wú)法有效抑制呼吸道中FCV 的復(fù)制。此外，接種部位有時(shí)會(huì)形成纖維肉瘤，以氫氧化鋁佐劑疫苗較為嚴(yán)重。

De man marc 等首次報(bào)道注射貓細(xì)小病毒（feline panleukopenia virus，F(xiàn)PLV）、皰疹病毒（feline herpesvirus，F(xiàn)HV）和FCV 滅活疫苗后在貓雙側(cè)胸部產(chǎn)生纖維肉瘤的案例[1]。Jas 等將由改性的FPLV、FHV，滅活的FCV 制備成的非佐劑重組疫苗RCPCh-FeLV 接種8～9周SPF貓，結(jié)果顯示，接種疫苗一周后，經(jīng)FHV和FCV 攻毒，免疫貓的臨床表現(xiàn)顯著低于對(duì)照組，F(xiàn)PV、FHV和FCV排出量顯著減少，證實(shí)接種疫苗的第7 天開(kāi)始產(chǎn)生免疫應(yīng)答[2]。

由于中和性表位大部分位于衣殼蛋白高變區(qū)，用單價(jià)FCV 疫苗不能完全預(yù)防FCV 感染。因此，為提高交叉中和反應(yīng)，多價(jià)疫苗成為FCV 疫苗新的研究方向。Poulet 研究證實(shí)了不同毒株具有交叉保護(hù)作用，隨后以具有交叉保護(hù)作用的FCV 株（FCV431 和FCVG1）制成了非佐劑滅活二價(jià)疫苗（PUREVAX RCPCh-FeLV），疫苗對(duì)異源株產(chǎn)生的免疫保護(hù)作用與體外交叉中和反應(yīng)有關(guān)，同時(shí)也說(shuō)明交叉中和試驗(yàn)可以用于選擇FCV 疫苗株，同樣適用于引起VSD 的高致病毒株[3]。Masubuchi 等研發(fā)了一種三價(jià)滅活疫苗Kyoto Biken Feline-CPR，其中包含的3 個(gè)FCV 株的免疫和基因特性差異較大，經(jīng)攻毒試驗(yàn)顯示，該疫苗更有潛力應(yīng)對(duì)蔓延整個(gè)日本的FCV 的抗原多樣性[4]。

1.2 減毒活疫苗 該類疫苗能較好地刺激機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性免疫，但存在毒力返祖問(wèn)題。有證據(jù)表明，活疫苗病毒在某些情況可能引起臨床癥狀，甚至引起流行感染。

Radford 等將疫苗失敗獲得的分離株的序列歸為兩類：大多數(shù)疫苗失敗獲得的分離株與疫苗株序列存在21.33%～38.00% 的差異，而在某些情況下僅產(chǎn)生0%～5.33% 的變異，說(shuō)明分離株可能來(lái)源于疫苗。此外，與來(lái)自同一個(gè)疾病暴發(fā)的分離株密切相關(guān)，僅產(chǎn)生0%～1.33% 的變異，而與流行病學(xué)無(wú)關(guān)的分離株存在20.67%～38.00%的差異[5]。Hohdatsu 等認(rèn)為商業(yè)的FCV 疫苗A、B、C和D 產(chǎn)生的免疫血清相對(duì)能較好地中和FCV 試驗(yàn)株：F4，F(xiàn)9，F(xiàn)CV-255。而對(duì)野毒株的中和效果不理想。說(shuō)明疫苗株和日本流行的FCV 株之間中和抗原差異顯著，需要改進(jìn)FCV 疫苗[6]。Porter研究表明，兩個(gè)FCV 疫苗株（FCV-F9 和FCV-255）仍然存在廣泛的交叉反應(yīng)，F(xiàn)9 抗血清中和87.5%，F(xiàn)CV-255 抗 血 清 中 和75%[7]。Kanellos 等 將 貓 抗FHV、FCV 和FPLV 的凍干三價(jià)改性減毒活疫苗溶解在液體重組的亞單位貓白血病病毒（feline leukemia virus，F(xiàn)eLV）（p45 包膜蛋白）中，結(jié)果顯示，混合兩個(gè)疫苗對(duì)安全和效果都沒(méi)有產(chǎn)生不利的影響[8]。Huang 研究發(fā)現(xiàn)，雙株FCV 疫苗（FCV 和VS-FCV）比單一毒株疫苗能刺激產(chǎn)生更廣泛的交叉中和抗體，并且能夠使免疫貓當(dāng)面臨一個(gè)伴隨致死性系統(tǒng)疾病的同源FCV 株感染時(shí)臨床癥狀減輕[9]。Lappin 將SPF 貓接種滅活或減毒活FVRCP（2 個(gè)改性的活的FVR、FCV、FeLV）疫苗后，兩個(gè)FVRCP 疫苗對(duì)FCV 血清反應(yīng)率間沒(méi)有數(shù)據(jù)上的差別[10]。

還有學(xué)者對(duì)該類疫苗接種部位、接種時(shí)間及非特異保護(hù)作用進(jìn)行研究。Lappin 等將SPF 貓接種FVRCP 疫苗，鼻內(nèi)接種與注射接種FVRCP 疫苗的貓比較，F(xiàn)CV 攻毒后，更有可能在1 d 和14 d 對(duì)血清轉(zhuǎn)化（疫苗產(chǎn)生抗體）[11]。Wilson 等研究發(fā)現(xiàn)，同時(shí)在貓不同部位注射佐劑疫苗FeLV 和貓多價(jià)疫苗或單次注射二者的混合疫苗后，能對(duì)FeLV，F(xiàn)CV，F(xiàn)HV，F(xiàn)PV強(qiáng)毒攻擊產(chǎn)生相同的保護(hù)效果。兩種注射方式在臨床評(píng)分或低水平持續(xù)抗原血癥上與對(duì)照組相比差異顯著[12]。Schultz 等研究發(fā)現(xiàn)，在16 周或以上接種單劑量的改性活病毒貓核心疫苗（抗FPLV，F(xiàn)CV和FHV）可以提供高比例動(dòng)物的長(zhǎng)期免疫力，同時(shí)也能增加群體免疫[13]。Bradley 等研究發(fā)現(xiàn)，鼻內(nèi)接種減毒活FHV-1 疫苗和FCV 疫苗的貓能減少由實(shí)驗(yàn)室感染的支氣管敗血波氏桿菌引起的臨床癥狀，這個(gè)非特異性免疫有利于抵抗疫苗不可用的感染并在疫苗引起體液免疫之前起到保護(hù)作用[14]。

2 新型疫苗

2.1 亞單位疫苗 此類疫苗以生物化學(xué)和物理方法從病毒培養(yǎng)物中提取、純化有特異性的抗原而制成。FCV 的結(jié)構(gòu)蛋白主要由VP1、VP2 組成，其中衣殼蛋白VP1 是誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)的主要結(jié)構(gòu)蛋白，由于它只含有病原體的一部分，不會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物發(fā)病。

Komolafe 等報(bào)道了FCV 亞單位疫苗，該疫苗來(lái)自于與整個(gè)FCV 抗原相似的亞單位組成。當(dāng)致命毒株攻毒時(shí)疫苗對(duì)貓有保護(hù)作用，而對(duì)照組則出現(xiàn)了FCV 引起的典型臨床和病理癥狀[15]。

2.2 活病毒載體疫苗 此類疫苗是將外源基因插入到某些病毒載體基因組內(nèi)，使之高效表達(dá)但不影響該疫苗株的正常生存與繁殖。

Yokoyama 等將編碼FCV-F4 株衣殼蛋白整個(gè)開(kāi)放閱讀框的基因插入到FHV-1 的胸苷激酶缺陷突變株（c7301dltk）的缺失位點(diǎn)（SmaI site）。重組病毒設(shè)計(jì)成C7301dlTK-Cap。通過(guò)眼內(nèi)、鼻腔和口腔途徑接種貓開(kāi)展體內(nèi)試驗(yàn)，免疫貓?jiān)诤艽蟪潭壬夏艿挚褂H本FCV F4 株和FHV1 C7301 株的致命感染。隨后又構(gòu)造了進(jìn)一步改進(jìn)的重組FHV-1（dlTK（gCp）-Cap），它在C7301dlTK-Cap FCV 前體衣殼蛋白基因上游帶有一個(gè)假定的FHV-1 gC 啟動(dòng)子序列。通過(guò)試驗(yàn)證實(shí)dlTK（gCp）-Cap 的FCV免疫原性抗原高表達(dá)，經(jīng)致死性的FCV 攻毒，顯示含有dlTK（gCp）-Cap的疫苗比含有C7301dITK-Cap 的疫苗更有效[16]。Mccabe 等在構(gòu)建了表達(dá)FCVF9 株衣殼基因的減毒重組黏液瘤病毒之后，將FCV F9、LS015 的衣殼蛋白基因分別插入到黏液瘤生長(zhǎng)因子（MGF）位點(diǎn)、絲氨酸蛋白酶抑制劑（SERP 2）基因位點(diǎn)，生產(chǎn)了一個(gè)表達(dá)FCVF9 和LS015 衣殼蛋白基因的二價(jià)黏液瘤重組體。免疫貓能夠?qū)9 株和LS015 株產(chǎn)生高水平的血清中和抗體。目前還沒(méi)有證據(jù)證明黏液瘤-FCV重組病毒從免疫的貓到未免疫的貓之間傳播，這種嵌合疫苗可能對(duì)廣泛的FCV 株產(chǎn)生有效的保護(hù)作用[17]。

2.3 核酸疫苗 此類疫苗是把外源基因克隆到真核質(zhì)粒表達(dá)載體上，然后將重組質(zhì)粒DNA 直接注射到動(dòng)物體內(nèi)，通過(guò)外源基因在體內(nèi)表達(dá)產(chǎn)生的抗原激活機(jī)體的免疫系統(tǒng)，進(jìn)而引發(fā)免疫反應(yīng)。DNA 疫苗不包含活病毒或人工佐劑，具有潛在的廣泛用途。

Sommerville 等將貓接種包含F(xiàn)CV-F9 株成熟衣殼蛋白的質(zhì)粒（pF9VAC），利用異源FCV LS027株進(jìn)行攻毒試驗(yàn)，雖然全部貓都出現(xiàn)臨床癥狀，但是疫苗組的直腸溫度和一般的臨床癥狀評(píng)分都顯著低于對(duì)照組，并且在潰瘍分布上也存在顯著的差異。雖然兩組在感染初期都沒(méi)有檢測(cè)到血清學(xué)反應(yīng)，但是在感染后期疫苗組滴度普遍高于對(duì)照組。結(jié)果顯示，DNA 疫苗對(duì)FCV 感染起到部分保護(hù)作用[18]。

2.4 病毒樣顆粒疫苗 FCV 成熟的衣殼蛋白能夠自我組裝成空衣殼即病毒樣粒子（VLPs），形態(tài)和抗原與天然毒株相似，包含一個(gè)分子量約為60 kDa 的衣殼蛋白，它不具有感染性。新的基于VLPs 免疫原性的免疫策略能夠提供改進(jìn)抗FCV感染的安全性。

Martino 等發(fā)現(xiàn)，利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)生成的FCV 衣殼蛋白產(chǎn)生的VLPs 能夠與FCV 抗血清反應(yīng)。VLPs 免疫家兔，能引起對(duì)臨床樣本中分離到的一些FCV 株的中和抗體。說(shuō)明利用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)生成的FCV 衣殼蛋白可能作為一個(gè)安全有效的抗FCV 的重組疫苗，該重組疫苗有助于描述VLPs 在抗原不同F(xiàn)CV 感染的效果，F(xiàn)CVVLP 被看作是抗FCV 感染的候選疫苗[19]。

3 結(jié)語(yǔ)

由于FCV 的變異和相關(guān)致死性疾病的發(fā)生，現(xiàn)在的疫苗很多都失去了效力，免疫失敗的案例時(shí)有發(fā)生，迫切地需要制備新型有效的疫苗。隨著反向遺傳操作技術(shù)的發(fā)展，應(yīng)用RNA 病毒反向遺傳系統(tǒng)可以重現(xiàn)病毒的生活周期和感染模式，對(duì)闡明病毒的起源、致病機(jī)制和免疫交叉保護(hù)提供一種切實(shí)可行的方法。我們課題組正致力于利用反向遺傳操作技術(shù)，制備一種新型疫苗，進(jìn)而減少由FCV 引起的致死性疾病的發(fā)生。

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