指紋圖譜技術(shù)在中草藥黃芪鑒別中的應(yīng)用

寧玉門(mén)

（商丘職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南省商丘市 476000）

每個(gè)人都有指紋，但指紋卻各不相同，每一味中藥的特性和有效成分也千差萬(wàn)別。通過(guò)提取這些特性，結(jié)合現(xiàn)代分析技術(shù)手段，將中藥的特性和有效成分表征出來(lái)(即指紋圖譜)，此過(guò)程是用指紋圖譜來(lái)評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量的基礎(chǔ)和關(guān)鍵。用適當(dāng)?shù)姆治鍪侄芜M(jìn)行中藥指紋圖譜研究是非常必要的。

1 中草藥指紋圖譜技術(shù)在中草藥質(zhì)量評(píng)定中的應(yīng)用

1.1 穩(wěn)定、質(zhì)量可靠的中藥材是建立指紋圖譜的基礎(chǔ)。中藥材是生產(chǎn)中藥飲片和中成藥的重要原料，是保證中藥飲片和中成藥質(zhì)量的關(guān)鍵和根本。中藥材的各種成分不僅因品種而異，也與其生長(zhǎng)環(huán)境、采收時(shí)間、炮制與貯存過(guò)程有關(guān)，因此中藥材的質(zhì)量非常不穩(wěn)定，這對(duì)于開(kāi)展中藥材指紋圖譜的研究是極其不利的，多種多樣的中藥材很難制訂出穩(wěn)定可靠的指紋圖譜。因此必須選擇足夠多的樣本，作為指紋圖譜的研究對(duì)象。

1.2 中藥材指紋圖譜的獲得和評(píng)價(jià)方法 以經(jīng)生藥學(xué)鑒定的中藥材為研究對(duì)象，用TLC、TLCS、HPLC、HPLC／MS、GC、GC/MS、MPCE等 現(xiàn) 代 分析技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行分析，獲取化學(xué)數(shù)據(jù)；并在藥效學(xué)指導(dǎo)下進(jìn)行指紋圖譜研究，能夠保證指紋圖譜反映的化學(xué)成分包括中藥材中有效部位所含絕大部分成分，或者有效成分的全部，將其綜合分析可以對(duì)中藥材的優(yōu)劣與真?zhèn)巫鞒雠袆e。

1.3 中藥材質(zhì)量的再評(píng)價(jià) 選擇10批此中藥材，按照已經(jīng)建立的分析處理方法，獲取樣品的指紋圖譜，以此指紋圖譜作為該中藥材的質(zhì)量控制指標(biāo)之一。將未知樣品的指紋圖譜與已經(jīng)建立的標(biāo)準(zhǔn)指紋圖譜進(jìn)行比較，即可評(píng)價(jià)未知樣品的真?zhèn)蝺?yōu)劣。

2 中藥材黃芩HPLC指紋圖譜檢測(cè)

2.1 儀器與試劑 儀器和設(shè)備:高效液相色譜儀,超聲波清洗器，電子分析天平。黃芪甲苷對(duì)照品,乙腈(色譜純),純化水;其余試劑均為分析純。藥材:黃芪均購(gòu)自亳州中藥材市場(chǎng)。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 色譜條件 色譜柱:HypersilODS(4mm×250mm5μm)色譜柱(Agilent1100);流動(dòng)相:乙腈 -水(30∶70)二元梯度洗脫;流速1mL/min;檢測(cè)波長(zhǎng)203nm;柱溫:30℃;分析時(shí)間:60min;進(jìn)樣量:20μL。

2.2.2 供試品溶液的制備 稱(chēng)取各黃芪藥材30.00g,剪碎,置具塞椎形瓶中,加甲醇140mL,浸泡過(guò)夜后,超聲提取10min,將溶液過(guò)濾,回收甲醇至干,殘?jiān)铀?0mL溶解后,轉(zhuǎn)移至分液漏斗中,以水飽和的正丁醇萃取3次,每次20mL,合并正丁醇萃取液,將正丁醇減壓回收至干,用甲醇溶解并定容至5.0mL量瓶中,制得樣品溶液。

2.2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取黃芪對(duì)照品適量,置10mL量瓶中,加甲醇溶解并稀釋至刻度,制成含黃芪1mg/mL的溶液,作為對(duì)照品溶液。

2.2.4 流動(dòng)相的選擇 試驗(yàn)過(guò)程中,系統(tǒng)比較了不同濃度的甲醇-水(70∶30,55∶45,45∶55)、乙腈-水(70∶30,50∶50,30∶70)等不同體系的二元梯度洗脫系統(tǒng)。試驗(yàn)結(jié)果表明,以乙腈-水(30∶70)二元梯度分離度最好,特征峰明顯,樣品90min圖譜顯示,60min樣品峰即可分離完全、無(wú)繼續(xù)特征峰出現(xiàn),因此,本文選取乙腈-水(30∶70)二元梯度洗脫體系為流動(dòng)相,分析時(shí)間為60min。

2.2.5 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇 吸取上述樣品溶液20μL進(jìn)樣,以乙腈-水(30∶70)二元梯度洗脫體系為流動(dòng)相,利用DAD檢測(cè)器進(jìn)行全波段掃描檢測(cè)分析,結(jié)果表明,該樣品在203nm處有比較顯著的特征色譜峰,因此,本文選取203nm作為檢測(cè)波長(zhǎng)。

2.2.6 參照物的選擇 通過(guò)對(duì)不同產(chǎn)地及相同產(chǎn)地不同批號(hào)黃芪藥材HPLC色譜圖系統(tǒng)考察,所有藥材中s號(hào)峰的含量較高,且較為穩(wěn)定,因此,選取s號(hào)峰作為參照物。測(cè)定方法 分別精密量取對(duì)照品溶液和各樣品溶液20μL,注入液相色譜儀,記錄60min色譜圖即得。以黃芪甲苷的色譜峰(s)的保留時(shí)間和峰面積為1,計(jì)算其它各峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的比值。

3 方法學(xué)考察

3.1 線(xiàn)性關(guān)系 分別精密吸取貯備液100,200,400,600,1100,2000μL,置1mL量瓶中,用甲醇稀釋至刻度,搖勻,取以上溶液各20μL,注入液相色譜儀,按上述條件進(jìn)行測(cè)定,各濃度分別測(cè)定2次,以進(jìn)樣量(μg)的常用對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo),以對(duì)照品峰面積的常用對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。求得回歸方程為:Y=1.0623X+1.633,r=0.9994,進(jìn)樣量在2.061～41.663μg內(nèi)呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

3.2 黃芪甲苷含量的測(cè)定 分別精密量取各樣品溶液20μL,注入液相色譜儀,按上述方法進(jìn)行測(cè)定,將測(cè)出的各樣品溶液峰面積的常用對(duì)數(shù)值代入回歸方程,計(jì)算出各樣品溶液的黃芪甲苷含量。

3.3 精密度試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液,連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣5次,每次進(jìn)樣20μL,按上述條件進(jìn)行測(cè)定,黃芪甲苷峰面積的RSD為2.44。

3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 以?xún)?nèi)蒙古呼和浩特產(chǎn)黃芪藥材為供試品,分別在0,2,8,12,24h進(jìn)樣,按上述條件進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果表明,各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積比值無(wú)明顯變化。說(shuō)明本方法穩(wěn)定。

3.5 重現(xiàn)性試驗(yàn) 取內(nèi)蒙古呼和浩特產(chǎn)黃芪藥材5份為供試品,按樣品溶液制備方法處理,按上述條件進(jìn)行測(cè)定,結(jié)果表明,各色譜峰的相對(duì)保留時(shí)間和單峰面積大于或等于10的峰(1,5,6,s號(hào)峰)面積比基本一致。

3.6 樣品測(cè)定 按樣品溶液的制備方法操作,分別取各批藥材制成樣品溶液,取20μL進(jìn)樣。同前條件測(cè)定圖譜,結(jié)果表明:5個(gè)不同產(chǎn)地的黃芪藥材有13個(gè)共有峰,其HPLC指紋圖譜基本一致,共有峰面積之和均大于各總峰面積的90,但其共有峰面積的比值有一定差異。

4 小結(jié)

試驗(yàn)結(jié)果表明,5個(gè)不同產(chǎn)地黃芪藥材指紋圖譜中主要峰群的整體圖貌基本一致。但各成分峰面積的相對(duì)比值有所不同,為快速鑒別區(qū)分不同來(lái)源的藥材提供了科學(xué)的依據(jù)。

本文采用HPLC色譜法,建立了黃芪藥材的指紋圖譜分析方法。結(jié)果表明:方法穩(wěn)定、可靠、重現(xiàn)性好。