德國牧羊犬精液4℃保存體系的建立

趙 禹 張文才 李向黨 張匯東

一、德國牧羊犬繁育工作現(xiàn)狀

德國牧羊犬由于其優(yōu)秀的工作能力及威武出眾的外貌特征，在我國警用犬種中一直占有較大比例，在犬種實際的繁殖工作中，遇到的問題也較多。如公犬性欲較低，不爬跨；母犬生殖道異常，不能完成自然交配等。

在育種工作中，目前國內(nèi)德國牧羊犬的育種工作尚未有效的開展。社會養(yǎng)犬業(yè)薄弱，選育犬方式也不是以工作性能為主。而警犬基地一般各自開展選育工作，盡管有些警犬基地遵循開放式核心群育種體系，但引種有限，導致優(yōu)秀血系不能有效拓展，近親現(xiàn)象較為嚴重，工作性能退化較為嚴重。這導致我國警方使用的德國牧羊犬一直在“引種——維持——退化——再引種”的怪圈中循環(huán)。而且，從外部環(huán)境來看，德國牧羊犬產(chǎn)地德國的德國牧羊犬協(xié)會（SV），由于近些年來育種目標逐漸傾向外貌性狀選擇，而弱化了德國牧羊犬工作性能的培育，使得德國本土的德國牧羊犬工作性能出現(xiàn)了退化的趨勢。同樣，遵循SV協(xié)會選種標準的歐洲其他國家的德國牧羊犬也出現(xiàn)了工作性能退化的趨勢。針對這一現(xiàn)狀，公安部沈陽警犬基地近年來有計劃有步驟的開展起沈陽片區(qū)德國牧羊犬聯(lián)合育種工作，目的就是盡可能搜集整合片區(qū)內(nèi)優(yōu)秀血系的德國牧羊犬種犬，發(fā)揮其最大價值，向同一個育種目標發(fā)展，為我國警方提供充足的工作性能優(yōu)秀的德國牧羊犬犬源。

二、人工授精技術(shù)的優(yōu)勢

犬的人工授精技術(shù)在犬繁殖工作中具有很多獨特優(yōu)點。如：可以使不能完成自然交配的母犬受孕而獲得后代；預防公母犬直接性接觸而傳播的疾??；可以對精液質(zhì)量評估增加受孕率；能夠省去母犬飼養(yǎng)者因配種而帶來的長途旅行的花費和不便；通過冷凍精液技術(shù), 長期保存優(yōu)良公犬的遺傳物質(zhì)等。

將犬的人工授精技術(shù)應(yīng)用于德國牧羊犬的繁育工作中同樣具有現(xiàn)實意義。如：使性欲較低的優(yōu)秀公犬及不能自然交配的母犬獲得后代；人工授精技術(shù)是性別控制技術(shù)的基礎(chǔ)，通過流式細胞儀將X、Y精子分離后進行人工授精，可以獲得預定性別的后代；犬人工授精技術(shù)是開展警犬聯(lián)合育種工作的技術(shù)基礎(chǔ)，可以提高警犬聯(lián)合育種工作的效率。

而犬精液的保存技術(shù)是成功開展犬人工授精工作的重點和難點。目前，國際上通常采用精液冷藏（4℃）及精液液氮冷凍（-196℃）兩種方式保存精液。其中，精液4℃冷藏保存方法由于不需像液氮冷凍保存時經(jīng)過精子細胞的冰晶期，對精子細胞造成的損傷較小，短期保存一段時間后精子質(zhì)量較好，使用陰道輸精方式就可以獲得較高的受孕率，操作上相對簡單，易于掌握，成本較低，在犬人工授精中具有一定的應(yīng)用價值。國外養(yǎng)犬發(fā)達國家已將此技術(shù)應(yīng)用于犬的實際繁殖工作中，特別適用于短途犬精液的運輸，一般2～3天內(nèi)到達后即進行人工授精，母犬妊娠率與自然交配妊娠率相當。相對于液氮冷凍保存唯一缺點是不能長期保存。而國內(nèi)尚未見犬精液4℃冷藏保存用于人工授精的報道。

三、德國牧羊犬精液4℃保存體系的建立

下面將德國牧羊犬精液4℃保存整個實驗步驟簡述如下。

（一）采精前準備

公犬精液采集在清潔、安靜的場地或公犬圈內(nèi)進行。每條公犬由所熟悉的人站立保定，為防意外可給犬戴上口籠。用0.1%的高錳酸鉀溶液清洗公犬陰莖部。

（二）精液的采集與分析

采用手握按摩法采精，按摩的速度和壓力可根據(jù)不同的公犬確定，一般情況下經(jīng)過1～2min的按摩，公犬的陰莖就可充分勃起并射精，采集公犬中段富含精子的精液，采精量一般在2ml以上。

采集精液后，立即觀察精液的氣味和色澤，乳白色或淡乳白色者為正常精液，用偉力精液檢測分析系統(tǒng)分析精液質(zhì)量參數(shù)，精子活力大于0.8，活率大于90%的用于接下來的實驗研究。

（三）精液的處理

將采集的犬精液裝入離心管中離心8分鐘，移去上清液，使用不同實驗設(shè)計的稀釋液2倍稀釋，密度在0.5×108個/ml以上，放于4℃冰箱內(nèi)保存。分別于12h、24h、36h、48h后使用精子檢測分析系統(tǒng)分析比較各組稀釋液的保存效果，確定最佳稀釋液配方。

（四）精液稀釋液的研究配制

本實驗以國內(nèi)外常用犬精液低溫保存的卵黃-Tris稀釋液為基礎(chǔ)，比較了不同濃度的葡萄糖與果糖對德國牧羊犬精液4℃保存效果的影響；同時研究了不同濃度的VE、還原性谷胱甘肽等抗氧化劑對德國牧羊犬精液4℃保存效果的影響。獲得了適宜德國牧羊犬精液4℃保存的穩(wěn)定的稀釋液配方，使德國牧羊犬精液4℃保存48h后精子質(zhì)量仍然較高，精子活力0.7以上，活率達到80%以上。

（五）人工授精

將于4℃保存48h的德國牧羊犬精液放于37℃水域鍋中1min，使用注射器將精液吸于注射器內(nèi)，將輸精管插于適宜配種的發(fā)情母犬陰道內(nèi)，將注射器內(nèi)的犬精液注入母犬體內(nèi)，之后將母犬后肢抬高，按摩母犬外陰部1～2min，完成輸精過程。

犬精液4℃保存體系的建立重點在于犬精液稀釋液的配制。本實驗研究以國外犬精液低溫保存稀釋液配方為基礎(chǔ)，對其進行了一定優(yōu)化，用于德國牧羊犬精液4℃保存。實驗獲得了穩(wěn)定可靠的德國牧羊犬精液4℃保存稀釋液配方，使德國牧羊犬精液4℃保存48h后精子質(zhì)量仍然較高（精子活力0.7以上，活率80%以上），完全滿足人工授精需要，可以用于開展人工授精工作。實驗選取4頭發(fā)情母犬用于人工授精對象，將實驗中4℃保存48h的德國牧羊犬精液采用陰道輸精法輸入發(fā)情母犬體內(nèi)，其中3頭母犬妊娠產(chǎn)仔，妊娠率達75%，平均窩產(chǎn)仔數(shù)7頭，仔犬發(fā)育良好。這一結(jié)果初步證明4℃保存德國牧羊犬精液一段時間后可以取得較高的母犬妊娠率及窩產(chǎn)仔數(shù)。同時，這一時間內(nèi)，幾乎可以實現(xiàn)沈陽片區(qū)內(nèi)任意兩個地區(qū)的運輸，從而實現(xiàn)人工授精技術(shù)在沈陽片區(qū)德國牧羊犬聯(lián)合育種中的應(yīng)用，促進沈陽片區(qū)德國牧羊犬聯(lián)合育種工作的開展。