參芪扶正注射液對肝癌細胞株H22的抑制作用及機制研究

薛 瑞，曹軍華，李瑞生，李 燦

0 引言

腫瘤是目前危害人類健康和導致死亡的主要疾病?；熓悄[瘤三大常規(guī)治療手段之一，但化療藥物作用缺乏選擇性，在殺傷腫瘤細胞的同時，對機體也帶來損傷，特別是對免疫功能有很大的影響。參芪扶正注射液是國內(nèi)首創(chuàng)的純中藥靜脈型大輸液，其主要成分為黨參、黃芪，具有益氣扶正的功效，為常用的抗腫瘤輔助藥，可減輕化療藥的毒副作用[1]。本研究觀察參芪扶正注射液體外對H22細胞增殖的抑制作用，體內(nèi)對H22荷瘤小鼠腫瘤生長的影響及對血清IFN-γ、TNF-α含量的影響，探討其抗腫瘤作用機制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物、材料與儀器 H22肝癌細胞由華中科技大學同濟醫(yī)學院提供；ICR小鼠，(20±2)g，雌雄兼用，由襄陽醫(yī)學院動物實驗中心提供，合格證號：襄醫(yī)動字第2001001號；參芪扶正注射液(麗珠集團利民制藥廠)；順鉑(江蘇豪森藥業(yè)股份有限公司)；5-Fu(天津金耀氨基酸有限公司)；胎牛血清(杭州四季青生物工程材料公司)；RPMI 1640培養(yǎng)粉(Gibco公司)；MTT和胰蛋白酶(Sigma公司)；ELx800型酶聯(lián)免疫檢測儀(BIO-TEK公司)；CO2孵箱(JOUAN公司)；干擾素-γ酶聯(lián)免疫試劑盒(北京艾然生物科技有限公司)；腫瘤壞死因子-α定量酶聯(lián)檢測試劑盒(上海森雄科技實業(yè)有限公司)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 MTT法測細胞抑制率 H22細胞置于5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中，用含100 mL/L小牛血清DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)，每24 h更換1次培養(yǎng)液，隔天傳代1次，取傳代后2 d處于對數(shù)生長期的細胞以1×105/mL密度接種于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后，分別加入順鉑(終濃度分別為10、20、40 μg/mL)，參芪扶正注射液(終濃度分別為5、10、20、40、80、160 μg/mL)，每組6個復孔，另設正常對照組。分別于48、72、96 h 3個時相各取一塊96孔板進行MTT比色實驗：每次于實驗結束前加入MTT，繼續(xù)培養(yǎng)4 h后，按常規(guī)采用酶標儀(波長570 nm)測各孔吸光度值(A)。按公式“(1-藥物孔A值/對照孔A值) ×100%”計算細胞抑制率，以劑量和生長抑制率作直線相關分析。

1.3 模型小鼠的建立、分組及給藥 ICR小鼠，除正常對照組外，每鼠接種0.2 mL H22細胞懸液于右腋窩皮下。24 h后，隨機分為荷瘤對照組、陽性對照組及參芪扶正3個劑量組，每組10只。正常對照和荷瘤對照組灌胃生理鹽水0.2 mL/d；陽性對照組腹腔注射5-Fu 25 mg/(kg·d);參芪扶正3個給藥組分別按照25、50、100 mg/(kg·d)灌胃給藥，皆給藥10 d。

1.4 抑瘤率的檢測 取血后，頸椎脫臼處死小鼠，立即完整剝離瘤塊，稱量瘤塊重量，計算各組平均瘤塊重量及抑瘤率，抑瘤率(%) =[1-(給藥組平均瘤重/陰性對照組平均瘤重)]×100%。

1.5 血清IFN-γ含量的檢測 停藥次日摘除眼球法取血，常規(guī)分離血清，按照小鼠酶聯(lián)免疫(ELISA)IFN-γ試劑盒使用說明操作，測定小鼠血清中IFN-γ的含量。

1.6 血清TNF-α含量的檢測 停藥次日小鼠摘眼球取血，分離血清，采用雙抗體夾心ABC-ELISA法測定血清TNF-α含量，參考說明書步驟操作，于492 nm處檢測吸光度值(A492 nm)，根據(jù)濃度標準曲線計算TNF-α含量。

2 結果

2.1 對H22細胞生長的抑制作用 顯微鏡下觀察，參芪扶正注射液作用后的H22細胞排列稀疏，隨作用時間延長和藥物濃度的增加細胞密度逐漸減少。MTT實驗結果顯示，各劑量組參芪扶正均可抑制H22細胞的增殖，隨著藥物濃度的增加和作用時間的延長，抑制率增加，參芪扶正對H22細胞的抑制作用具有統(tǒng)計學意義。結果見圖1。

圖1 參芪扶正對H22細胞增殖的抑制作用

2.2 對荷瘤小鼠腫瘤生長的抑制作用 實驗結果顯示，5-Fu和參芪扶正三個劑量組瘤塊重量均明顯低于荷瘤對照組(P<0.01，P<0.001)，參芪扶正高、中、低三個劑量的抑瘤率分別為47.43%、32.43%和21.42%，呈現(xiàn)劑量依賴性，提示參芪扶正注射液對H22荷瘤小鼠腫瘤的生長具有明顯的抑制作用，結果見表1。

表1 參芪扶正注射液對荷H22小鼠的抑制作用

注：與陰性對照組比較，*P<0.01；**P<0.001

2.3 對荷瘤小鼠血清IFN-γ含量的影響 H22荷瘤小鼠IFN-γ含量明顯受到抑制，與空白組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；5-Fu抑制荷瘤小鼠血清IFN-γ的形成，與荷瘤對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；參芪扶正三個劑量組均可提高荷瘤小鼠血清IFN-γ含量，與荷瘤對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05，P<0.01)，見表2。

2.4 對荷瘤小鼠血清TNF-α含量的影響 荷瘤對照組小鼠的TNF-α含量明顯低于空白對照組(P<0.01)；5-Fu能夠提高荷瘤小鼠的TNF-α含量，與荷瘤對照組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；參芪扶正中、高劑量可提高荷瘤小鼠的血清TNF-α含量，與模型組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見表3。

表2 參芪扶正注射液對荷瘤小鼠IFN-γ的影響

注：與空白對照組比較，△P<0.01；與荷瘤對照組比較，*P<0.05；**P<0.01

表3 參芪扶正對荷瘤小鼠血清TNF-α 含量的影響

注：與空白對照組比較，△P<0.01；與荷瘤對照組比較，*P<0.05

3 討論

體質內(nèi)虛是腫瘤發(fā)生的主要病因，正氣虧損，正邪斗爭始終存在于腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中[2]。腫瘤因正氣虛而得病，因虛而致實，故在惡性腫瘤治療方面，祛邪雖不可輕視，但益氣扶正占有更加舉足輕重的地位。中藥制劑參芪扶正注射液是采用黃芪、黨參等中藥為主要原料，根據(jù)傳統(tǒng)中醫(yī)理論，運用現(xiàn)代制藥工藝研制而成，具有扶正固本、益氣補虛、活血化瘀的功效[3-6]。從中醫(yī)理論上參芪扶正注射液應具有良好的抗腫瘤作用。MTT實驗結果顯示，參芪扶正注射液體外可抑制H22細胞的增殖，且抑制率具有濃度和時間依賴性；體內(nèi)實驗觀察到參芪扶正注射液可明顯抑制荷H22小鼠腫瘤的生長。

IFN-γ是一種糖蛋白，具有較強的免疫調(diào)節(jié)功能，能增強細胞功能，加快免疫復合物清除和提高吞噬異物功能，對淋巴細胞具有雙向調(diào)節(jié)作用[7-8]。TNF-α主要由單核-巨噬細胞產(chǎn)生，可以直接殺傷腫瘤細胞，也可通過抑制腫瘤血管生成等間接途徑殺傷腫瘤細胞，還可誘導許多不同來源腫瘤細胞凋亡[9]，是迄今為止所發(fā)現(xiàn)的抗腫瘤作用最強的生物活性因子之一?，F(xiàn)在，IFN-γ和TNF-α在腫瘤的免疫調(diào)控監(jiān)視及腫瘤發(fā)生與發(fā)展中的作用越來越受到重視[10]。

本研究結果顯示，荷瘤對照組小鼠血清IFN-γ和TNF-α含量都明顯受到抑制，說明小鼠荷瘤以后其免疫功能受到抑制。參芪扶正注射液3個給藥組皆可顯著促進荷瘤小鼠血清中IFN-γ和TNF-α的表達，這為參芪扶正注射液通過增強荷瘤機體免疫功能而發(fā)揮抗腫瘤作用提供了免疫分子學依據(jù)。參芪扶正注射液抗腫瘤作用還有其他機制，有待進一步研究。

參考文獻：

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