術(shù)前間質(zhì)化療對(duì)口腔鱗狀細(xì)胞癌中Ki－67、Caspase－3蛋白的影響＊

金 彬，玄云澤，李京旭，金光澤，吳潤(rùn)國(guó)

（延邊大學(xué)附屬醫(yī)院口腔科，吉林延吉 133000）

口腔鱗狀細(xì)胞癌（oral squamous cell carcinoma，OSCC）是口腔頜面部最常見(jiàn)惡性腫瘤。Ki－67和Caspase－3是表達(dá)細(xì)胞增殖和凋亡的主要蛋白之一，能準(zhǔn)確地反應(yīng)腫瘤細(xì)胞的增殖活性和凋亡情況［1－2］。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)PV－6000通用型二步法檢測(cè)緩釋5－氟尿嘧啶術(shù)前間質(zhì)化療后高分化 OSCC中 Ki－67、Caspase－3的表達(dá)，為其臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇延邊大學(xué)附屬醫(yī)院口腔科2001～2009年收治的高分化OSCC患者60例，其中，30例術(shù)前均未接受過(guò)任何抗腫瘤藥物治療，15例為術(shù)前平陽(yáng)霉素靜脈化療，15例為術(shù)前緩釋5－氟尿嘧啶間質(zhì)化療，且經(jīng)蘇木素－伊紅（HE）染色病理診斷證實(shí)60例均為高分化OSCC。術(shù)前向患者及其家屬交代病情及治療方案，經(jīng)同意后分為未化療組、靜脈化療組和間質(zhì)化療組。其中，男47例，女13例；年齡29～80歲，平均60.1歲。按發(fā)病部位：舌癌17例，口底癌18例，頰癌6例，軟腭癌3例，牙齦癌8例，唇癌8例。根據(jù)世界抗癌聯(lián)盟（UICC）TNM臨床分類分期方法（2002）分為：Ⅰ期29例，Ⅱ期24例，Ⅲ期7例。

1.2 方法

1.2.1 化療方案 間質(zhì)化療方法：將5－氟尿嘧啶100mg緩釋劑（100mg／支，植入劑為白色圓柱形顆粒，長(zhǎng)4.0mm，直徑0.8 mm；安徽中人科技有限公司研制；批準(zhǔn)文號(hào)為國(guó)藥準(zhǔn)字H20030345）；植入于腫瘤組織、瘤周組織或腫瘤切除后的周?chē)M織內(nèi)，給藥后7～10d均行手術(shù)。靜脈化療方法：15例行平陽(yáng)霉素單一化療，化療結(jié)束后1周內(nèi)手術(shù)切除腫瘤；化療采用天津市河北制藥廠生產(chǎn)的鹽酸平陽(yáng)霉素注射劑（8mg／支），靜脈滴注給藥，每天1次，每次8mg，連續(xù)8～12d。化療完成后1周內(nèi)，如無(wú)手術(shù)禁忌則行手術(shù)。

1.2.2 病理切片 每個(gè)標(biāo)本連續(xù)切片4張，厚4μm，3張進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，1張進(jìn)行HE染色。

1.2.3 染色方法 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，洗3次，每次2min。將切片浸入pH 6.0檸檬鹽溶液加熱至沸騰，切片放入其中繼續(xù)加熱3min抗原修復(fù)，置室溫下自然冷卻后PBS沖洗，每次洗5min，共洗3次。3%H2O2去離子水孵育5～10min，以消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，室溫10min，PBS沖洗，洗3次，每次5min。每片滴加一抗（Ki－67，Caspase－3），4 ℃冰箱過(guò)夜，PBS沖洗，洗 3次，每次5 min。每片滴加通用型IgG抗體－HRP多聚體（二抗），37℃溫箱孵育30～60min，PBS沖洗，洗3次，每次5min。每片滴加新鮮配制的DAB溶液顯色5min，在顯微鏡下掌握染色程度。自來(lái)水充分沖洗，蘇木素復(fù)染、脫水、透明、中性樹(shù)膠封片鏡檢，試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3 結(jié)果判斷 Ki－67的結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：Ki－67蛋白在細(xì)胞核上出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)，每張切片中觀察5個(gè)高倍視野，每個(gè)視野1000個(gè)腫瘤細(xì)胞中計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)，取其均值并以百分?jǐn)?shù)表示，作為Ki－67細(xì)胞增殖指數(shù)。

圖1 OSCC組織中Ki－67陽(yáng)性表達(dá)圖（免疫組織化學(xué)×200）

圖2 OSCC組織中Caspase－3陽(yáng)性表達(dá)圖（免疫組織化學(xué)×400）

Caspase－3蛋白的結(jié)果判定標(biāo)準(zhǔn)：Caspase－3蛋白主要表現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)中，在顯微鏡下觀察5個(gè)高倍視野。陽(yáng)性表達(dá)是以下2組分?jǐn)?shù)的和：（1）按陽(yáng)性細(xì)胞所占比例計(jì)分，無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞為0分，陽(yáng)性細(xì)胞小于25%為1分，25%～50%為2分，＞50%為3分。（2）按切片中細(xì)胞染色強(qiáng)度計(jì)分，細(xì)胞無(wú)顯色為0分，呈淺黃色為1分，呈棕黃色為2分，呈棕褐色為3分。（1）＋（2）為總評(píng)分（－～＋＋＋）：其中0～1分為（－），2分為（＋），3～4分為（＋＋），5～6分為（＋＋＋）。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS13.0軟件進(jìn)行分析處理，計(jì)量資料以表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 高分化OSCC癌中心和癌旁黏膜中Ki－67表達(dá) 在OSCC組織中Ki－67陽(yáng)性反應(yīng)定位于細(xì)胞核內(nèi)，細(xì)胞質(zhì)與胞膜不著色，呈棕黃色顆粒，分布于癌巢中，化療后陽(yáng)性表達(dá)明顯減少（圖1）。在癌中心與癌旁黏膜中Ki－67在3組之間陽(yáng)性表達(dá)率比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1～2。

表1 各組高分化OSCC癌中的Ki－67表達(dá)比較（）

表1 各組高分化OSCC癌中的Ki－67表達(dá)比較（）

a：P＜0.05，與未化療組比較；b：P＜0.05，與間質(zhì)化療組比較。

組別 n Ki－67未化療組30 307.26±62.14靜脈化療組 15 162.32±21.34ab間質(zhì)化療組 15 111.32±10.34a

2.2 高分化OSCC中未化療組與化療組Caspase－3表達(dá)Caspase－3的陽(yáng)性細(xì)胞主要表現(xiàn)在細(xì)胞質(zhì)中，少數(shù)在細(xì)胞核，化療后陽(yáng)性表達(dá)明顯增高（圖2）?；熀驝aspase－3表達(dá)較化療前顯著增高，癌中心Caspase－3在3組之間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表2 各組高分化OSCC癌旁黏膜Ki－67表達(dá)比較（）

表2 各組高分化OSCC癌旁黏膜Ki－67表達(dá)比較（）

a：P＜0.05，與未化療組比較；b：P＜0.05，與間質(zhì)化療組比較。

組別 n Ki－67未化療組30 193.32±26.34靜脈化療組 15 123.32±13.34ab間質(zhì)化療組 15 67.32±11.34a

表3 各組高分化OSCC中Caspase－3表達(dá)比較（）

表3 各組高分化OSCC中Caspase－3表達(dá)比較（）

a：P＜0.05，與未化療組比較；b：P＜0.05，與間質(zhì)化療組比較。

組別 n Caspase－3未化療組30 2.81±0.125靜脈化療組 15 4.75±0.43ab間質(zhì)化療組 15 5.46±0.34a

3 討 論

細(xì)胞增殖與凋亡相輔相成，協(xié)同調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)細(xì)胞數(shù)目及狀態(tài)的穩(wěn)定，細(xì)胞增殖失控及細(xì)胞凋亡失衡可導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生發(fā)展。腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡與腫瘤的生物學(xué)行為之間有密切關(guān)系，且影響患者的預(yù)后。術(shù)前化療可使腫瘤體積縮小，減少微小轉(zhuǎn)移灶和術(shù)中播散的可能，提高了局部控制能力，減少局部復(fù)發(fā)［3－4］。間質(zhì)化療與靜脈化療相比，可明顯提高局部組織內(nèi)藥物濃度，延長(zhǎng)藥物與癌細(xì)胞作用時(shí)間，抑制腫瘤生長(zhǎng)和減少局部復(fù)發(fā)［4－5］。因術(shù)前化療抑制OSCC增殖、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，因此，檢測(cè)術(shù)前化療前后口腔癌組織中Ki－67、Caspase－3蛋白變化，對(duì)評(píng)價(jià)其療效有幫助［6］。

Ki－67與細(xì)胞增殖密切相關(guān)，G0期外所有細(xì)胞周期中均能表達(dá)，能準(zhǔn)確地反映腫瘤細(xì)胞的增殖活性。Ki－67蛋白的高表達(dá)可以反映腫瘤的高惡性度及高復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移傾向，OSCC中Ki－67蛋白高表達(dá)者與低表達(dá)者之間局部復(fù)發(fā)有差異，兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）［7－8］。Archer等［9］研究了64例浸潤(rùn)性乳腺癌誘導(dǎo)化療后Ki－67蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)化療后Ki－67蛋白表達(dá)明顯減少，化療前后差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），認(rèn)為誘導(dǎo)化療可減少乳腺癌細(xì)胞增殖。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在高分化OSCC患者中，術(shù)前間質(zhì)化療后癌中心及癌旁黏膜中Ki－67表達(dá)與靜脈化療和未化療組相比顯著下降（P＜0.05）。金成日等［10］對(duì)延邊地區(qū)50例OSCC進(jìn)行 Ki－67與臨床分期之間相關(guān)性研究，Ⅰ、Ⅱ期時(shí)Ki－67表達(dá)率明顯低于Ⅲ、Ⅳ期。本實(shí)驗(yàn)中未化療組Ⅰ、Ⅱ期占90.0%、Ⅲ期占10.0%，靜脈化療組分別占93.3%和6.7%，間質(zhì)化療組分別占80.0%和20.0%，按理Ki－67蛋白表達(dá)在間質(zhì)化療組中最高，其次為未化療組和靜脈化療組，但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果由高向低順序依次為未化療組、靜脈化療組和間質(zhì)化療組，而且高分化OSCC患者中Ki－67在間質(zhì)化療組與未化療組和靜脈化療組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。因此，更能說(shuō)明術(shù)前間質(zhì)化療與未化療和靜脈化療組相比，明顯降低了OSCC細(xì)胞的增殖活性，抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)。

細(xì)胞增殖、分化、凋亡是體內(nèi)組織保持平衡的主要特征，抑制細(xì)胞凋亡是通過(guò)延長(zhǎng)細(xì)胞壽命和維持癌組織生長(zhǎng)來(lái)引起癌的主要發(fā)病機(jī)理之一［11］。天冬氨酸特異性半胱氨酸蛋白酶（cysteinyl aspartate－specific proteinases，Caspases）級(jí)聯(lián)反應(yīng)是調(diào)控細(xì)胞凋亡的主要途徑之一。Caspase－3蛋白是該家族成員中執(zhí)行細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵酶之一，主要分布在細(xì)胞質(zhì)，在細(xì)胞凋亡中起關(guān)鍵作用［12］。Chen 等［2］報(bào)道，Caspase－3蛋 白基因變異可能與頭頸部鱗癌發(fā)生有關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道，星孢菌素通過(guò)活化Caspase－3蛋白途徑來(lái)促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡［13］。郭建文等［14］報(bào)道，平陽(yáng)霉素化療后OSCC組織中Caspase－3蛋白表達(dá)量較化療前顯著升高。張志偉等［15］報(bào)道，OSCC組織中Caspase－3蛋白表達(dá)與OSCC患者的臨床分期呈負(fù)相關(guān)。本組實(shí)驗(yàn)中Ⅰ、Ⅱ期和Ⅲ期Caspase－3蛋白陽(yáng)性表達(dá)率，未化療組為90.0%和10.0%，靜脈化療組為93.3%和6.7%，間質(zhì)化療組為80.0%和20.0%，按理Caspase－3表達(dá)靜脈化療組中最高，其次為未化療組和間質(zhì)化療組，但本實(shí)驗(yàn)結(jié)果由高向低順序依次為間質(zhì)化療組、靜脈化療組和未化療組，而且高分化OSCC患者中Caspase－3在間質(zhì)化療組與未化療組和靜脈化療組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。所以，術(shù)前間質(zhì)化療可明顯提高Caspase－3蛋白表達(dá)，促進(jìn)OSCC細(xì)胞凋亡，從而抑制腫瘤生長(zhǎng)。雖然本次試驗(yàn)病例數(shù)較少，但通過(guò)本實(shí)驗(yàn)可認(rèn)為，抑制癌細(xì)胞增殖、促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡是術(shù)前間質(zhì)化療發(fā)揮療效的有效途徑之一。

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