SHR大鼠左室肥厚與室性心律失常發(fā)生的相關性研究

黃 穎，伍偉鋒

（1.廣西壯族自治區(qū)民族醫(yī)院心血管內科二病區(qū)，廣西南寧 530001；2.廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院心血管病研究所，廣西南寧 530021）

臨床研究已明確，約30%高血壓患者有左室肥厚（left ventricular hypertrophy，LVH），這類患者的心血管病病死率較無 LVH 的高血壓患者高8倍（16%vs.2%）［1－2］，一個十分重要的原因在于前者容易發(fā)生室性心律失常（ventricular arrhythmia，VA），但與之相關的基礎性研究較少，特別是有關SHR大鼠LVH與VA發(fā)生關系方面，目前尚無報道。Langendorff灌注是采用恒壓或恒流方式從主動脈根部逆向用含氧灌流液灌流，保持哺乳動物離體心臟存活從而對VA動物模型觀察心功能的方法，排除了神經、體液因素和心臟前后負荷等對實驗的影響。本研究旨在通過觀察SHR大鼠和對照大鼠的離體心臟在Langendorff灌注低鉀液時誘發(fā)VA的敏感性差異，從動物實驗角度為LVH在高血壓患者誘發(fā)VA中的作用做進一步驗證。

1 材料與方法

1.1 主要材料 7周和15周的雄性SHR大鼠（由上海斯萊克實驗動物中心提供），用尾袖法連續(xù)無創(chuàng)測鼠尾動脈壓1周，時間均固定于8：00～14：00，每只大鼠在其安靜狀態(tài)下測量血壓3次，隨機取血壓平均值超過正常上限的大鼠各12只入組，分為16周高血壓的LVH組和8周高血壓無LVH的非LVH對照組，另購15周雄性Wistar大鼠12只連續(xù)測壓1周確定血壓在正常水平后作為空白對照組。Masson染色試劑盒（上海生工）；Langendorff離體心臟灌流系統(tǒng)、ALC－B5恒流泵、MPA－心功能分析系統(tǒng)（上海奧爾科特生物科技有限公司）；MS4000U生物信號定量記錄分析系統(tǒng)（廣州市龍飛達科技有限公司）；XD－2A型心臟電生理診療儀（蘇州東方電子儀器廠）；針灸針電極，自制。本實驗所需其余試劑均為國產分析純。

1.2 方法

1.2.1 Langendorff離體心臟灌注 用木錘擊昏動物后，迅速將心臟連同一段主動脈取出，將主動脈套進心臟插管口內固定。心臟經充氧的溫K－H液（以95%O2＋5%CO2混合氣飽和，恒溫37 ℃，NaCl 6.92g／L，KCl 0.35g／L，CaCl20.28 g／L，MgSO4·7H2O 0.29g／L，KH2PO40.16g／L，NaHCO32.1g／L，葡萄糖2.0g／L，pH 7.4）預灌流。將2個電極分別置于心臟心尖部和主動脈根部，連接多道生物信號記錄儀。首先灌流K－H液20min后，灌入低鉀液（KCl 0.175g／L，其余同普通K－H液）60min（除非持續(xù)時間大于2min的SVF提早出現(xiàn)），同時記錄心臟心室內壓和流出液，心電示波器全程監(jiān)測并記錄心電圖（ECG），觀察各組發(fā)生心律失常的情況。參照心律失常評分標準［2］進行評分，并參照文獻［3］剔除不合格樣本。

1.2.2 大鼠心肌組織病理學檢查 將大鼠離體心臟用生理鹽水沖洗吸干，將左心室游離壁心肌組織固定于10%甲醛液中作常規(guī)石蠟切片，蘇木素－伊紅（HE）染色后鏡檢以檢測大鼠心肌組織病理學改變。

1.2.3 大鼠心肌組織Masson染色觀察左室心肌間質纖維沉積 5μm組織切片；常規(guī)脫蠟；蘇木素染色2min，水洗；1%鹽酸乙醇分化，流水沖洗10min；麗春紅酸性品紅染5min，水洗。1%磷鋁酸處理1min；2%苯胺藍染1min，1%冰醋酸浸洗1min；95%乙醇快速滴洗3次；常規(guī)脫水、透明、封片；光鏡觀察。計算心肌組織膠原纖維面積占整個組織面積的百分比，即膠原容積分數（CVF）＝膠原面積／總面積，所有標本均取3個視野測量，計算其均值。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料以表示，多組間比較采用方差分析（ANOVA），組間兩兩比較采用ANOVA中的q檢驗法；計數資料采用Fisher確切概率法檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 Langendorff離體心臟灌注各指標比較 Langendorff灌注標準K－H液過程中，各組心率未見明顯差異（P＞0.05）；灌注低鉀液1～5min后各組心率有所降低。灌注低鉀液后，室性心動過速（ventricular tachycardia，VT）、室性早搏（ventricular premature beat，PVB）出現(xiàn)時間早于短暫室顫（transient ventricular fibrillation，TVF）或持續(xù)性室顫（sustained ventricular fibrillation，SVF）。灌流低鉀液后，LVH組開始出現(xiàn)VA的時間明顯早于非LVH對照組和空白對照組（P＜0.05）。隨后，LVH組出現(xiàn)SVF的時間（8min后）也明顯早于非LVH對照組和空白對照組（18min后）。LVH組的VA評分與非LVH對照組和空白對照組相比較均顯著增高（P＜0.05），見表1。

表1 Langendorff離體心臟灌注各指標比較

續(xù)表1 Langendorff離體心臟灌注各指標比較

2.2 大鼠心肌組織病理變化 空白對照組表現(xiàn)為大鼠左心室心肌纖維間質和細胞形態(tài)大小接近正常，胞漿染色均勻。LVH組大鼠的心肌細胞間質增多，心肌纖維可見溶解斷裂，細胞明顯肥大。非LVH對照組病理改變介于LVH組和空白對照組之間。

2.3 Masson染色觀察左室心肌間質纖維沉積 LVH組心肌內膠原組織明顯增多，圍繞心肌細胞的膠原纖維網斷裂、排列紊亂；空白對照組肌間隙很窄，無明顯膠原組織分布，相鄰細胞的膠原纖維網完好，著色淡；非LVH對照組介于LVH組和空白對照組之間。LVH組（0.30±0.05）與非LVH對照組（0.10±0.03）、空白對照組（0.08±0.03）比較，CVF明顯增高（P＜0.05），表明LVH組大鼠左心室出現(xiàn)了明顯重構現(xiàn)象，與非LVH對照組、空白對照組比較差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），非LVH對照組和空白對照組比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

3 討 論

多項臨床研究證明，伴有LVH的高血壓患者容易引發(fā)VA，從而增加心血管事件尤其是猝死風險。Fialová等［4］對由L－NAME誘導的高血壓大鼠和SHR大鼠2種模型的Langendorff離體心臟灌注低鉀液后發(fā)現(xiàn)，室顫發(fā)生率均明顯高于正常對照組（83.3%vs.62.5%vs.25%～33.3%），并伴隨著連接蛋白43（Cx43）表達降低。作者由此認為，由高血壓介導的縫隙連接重構是促使惡性VA發(fā)生的重要因素，這為本研究提供了先證。

高血壓左室重構主要表現(xiàn)為LVH和心肌纖維化，而LVH即心肌細胞肥厚主要表現(xiàn)為心肌細胞體積的增大和“胎兒化表型”的出現(xiàn)。SHR大鼠的病理生理狀態(tài)與人類原發(fā)性高血壓非常接近，5～6周齡時開始逐漸出現(xiàn)血壓增高，14～16周齡時LVH已明確形成并逐漸進展，是應用于高血壓發(fā)病機制研究的理想動物模型。本研究采用Langendorff低鉀液灌流對SHR大鼠以及正常大鼠的左室心肌組織進行VA的誘發(fā)后發(fā)現(xiàn)，LVH組大鼠心肌間質增多，心肌細胞明顯肥大。LVH組大鼠心臟在灌流低鉀液后發(fā)生各種VA的概率明顯高于非LVH對照組和空白對照組，提示K＋紊亂更容易促使LVH心肌誘發(fā)惡性心律失常，與Tribulova等［5］研究結論相一致。可能的機制為［6］：肥厚心肌增加了細胞興奮性和傳導性，纖維化和灶性肌溶壞死使局部心肌細胞電活動不穩(wěn)定而產生折返環(huán)、室壁肥厚、耗氧量增加導致心肌復極的延緩及離散等。在此病理基礎上由低鉀液灌流引發(fā)急性電生理失衡時，細胞外K＋濃度降低，依賴于膜電位的快鈉通道失活，進一步惡化LVH所致心肌病理改變，導致心肌產生鈣超載［7－8］。后者能夠激活Ca2＋依賴的蛋白酶Calpains而導致溶酶體釋放［9］，還可促使Cx43降解增加［10］。而Cx43是哺乳動物心肌縫隙連接中主要的連接蛋白之一，其數量和分布的異常正是多種VA發(fā)生的解剖學基礎［11］。

另一方面，本實驗發(fā)現(xiàn)，隨著低鉀液灌注時間的延長，LVH組與非LVH對照組、空白對照組比較，大鼠離體心臟在低鉀液灌注后明顯易感惡性VA，且VA發(fā)生嚴重程度更高，起始時間更早，持續(xù)時間更久，見表1。由此說明，LVH不僅與心血管事件密切相關，而且還可能是急慢性心血管事件（如急性低鉀血癥）引發(fā)VA的重要背景環(huán)境，甚至可能作為心血管事件重要的預測指標。在此之前，Kannel等［12－13］就觀察到，當個體在心臟超聲下確診LVH時，總病死率增加5倍，心血管事件病死率增加8倍，男性和女性的猝死率各增加6倍和3倍。在另一項多因素分析研究中［14］，有人指出男性患者左心室體積每增加50g／m2，心血管疾病死亡的相對風險指數就增加1.73，而女性數值為2.12。Martins等［15］也發(fā)現(xiàn)，將22只正常血壓和18只慢性高血壓伴有LVH的犬進行左前降支冠狀動脈結扎術3h后，在存活下來的8只LVH犬中有7只和8只無LVH的正常血壓犬中出現(xiàn)持續(xù)性單型VA。這些研究也強烈支持本實驗觀點。

本研究運用Langendorff低鉀液灌流SHR大鼠LVH離體心臟模型，結果顯示伴有LVH的SHR大鼠VA的發(fā)生概率和嚴重程度較無LVH的SHR大鼠明顯增加，提示LVH與VA的發(fā)生密切相關，LVH可能正是高血壓負荷下急慢性心血管事件引發(fā)VA的必要背景環(huán)境，進一步地確證了臨床上認為伴有LVH的高血壓患者的VA發(fā)生率較無LVH的高血壓患者明顯增高的觀點，為VA發(fā)生的分子機制研究提供了可靠的數據基礎。

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