雙歧桿菌四聯(lián)活菌片聯(lián)合芪倍合劑對潰瘍性結(jié)腸炎患者T細(xì)胞亞群及Fas／FasL系統(tǒng)表達(dá)的調(diào)節(jié)＊

郭曉鶴，張彩鳳△，夏永華，朱艷麗，秦詠梅，韓 宇

（1.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院：1.消化科；2.皮膚科，河南新鄉(xiāng) 453100）

潰瘍性結(jié)腸炎（ulcerative colitis，UC）屬于炎癥性腸?。╥nflammatory bowel disease，IBD）的一種，是一種局限于結(jié)腸和直腸黏膜或黏膜下層的、邊界清楚的炎性反應(yīng)。病變以遠(yuǎn)端結(jié)腸受累多見，但也可累及整個結(jié)腸。臨床主要表現(xiàn)為腹痛、腹瀉、黏液膿血便、里急后重等，病程纏綿，易反復(fù)發(fā)作，治療無特異性。發(fā)病機制與免疫、遺傳和環(huán)境等因素有關(guān)［1］，免疫學(xué)說在UC的病因?qū)W中日益受到重視，微生態(tài)制劑雙歧桿菌四聯(lián)活菌片（以下簡稱為四聯(lián)活菌片）為腸道菌群調(diào)節(jié)藥物，可直接補充人體正常生理細(xì)菌，在腸道形成生物屏障，抑制腸道中某些致病菌，促進(jìn)腸道蠕動，調(diào)整腸道菌群平衡，激發(fā)機體免疫力。芪倍合劑（豫藥制字Z04070018）是本院根據(jù)張仲景之大黃附子湯加味研制的一種灌腸劑，包括：黃芪300g，附子60g，大黃50g，干姜30g，五倍子50g，赤石脂600g，白及50g，其臨床療效肯定。用四聯(lián)活菌片聯(lián)合芪倍合劑治療UC，并對UC患者治療前后外周血T淋巴細(xì)胞亞群及Fas／FasL系統(tǒng)表達(dá)水平進(jìn)行檢測，探討UC發(fā)病的免疫機制及聯(lián)合用藥的免疫調(diào)控作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料 觀察病例為2009年6月至2012年6月本院消化科門診及住院的UC患者120例，其中，男53例，女67例，年齡13～75歲，平均（38.6±7.8）歲，病程3個月至18年，平均（5.6±2.1）年，用隨機數(shù)字表抽樣法分為3組，第一組為四聯(lián)活菌片聯(lián)合芪倍合劑治療患者40例，第二組為四聯(lián)活菌片治療患者40例，第三組為芪倍合劑治療患者40例，3組性別、年齡、病程、嚴(yán)重程度及分型差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。同樣方式抽取40名體檢者為健康對照組，其中，男18例，女22例，年齡18～57歲，平均（28.6±6.8）歲，均無免疫性疾病及系統(tǒng)性疾病史，本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)及納入標(biāo)準(zhǔn) 根據(jù)2007年制訂的對中國炎癥性腸病診斷治療規(guī)范的標(biāo)準(zhǔn)［2］，在排除細(xì)菌性痢疾、阿米巴痢疾、慢性血吸蟲病、腸結(jié)核等感染性結(jié)腸炎、結(jié)腸克羅恩病、缺血性腸炎等疾病后，按以下診斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）有典型臨床表現(xiàn)，并至少有內(nèi)鏡3項特征性改變的1項和（或）黏膜活檢，可診斷為本?。唬?）有典型臨床表現(xiàn)，并至少有X線鋇劑灌腸特征性改變3項中的1項，可診斷為本??；（3）臨床癥狀不典型，但有典型內(nèi)鏡或X線鋇劑灌腸所見者，擬診為本病，并觀察發(fā)作情況。UC患者依據(jù)True－Love標(biāo)準(zhǔn)，將病情分為輕型、中型和重型。輕型：患者腹瀉每日4次以下，便血輕或無，無發(fā)熱，脈搏加快或貧血，血沉正常；中型：介于輕度與重度之間；重型：腹瀉每日6次以上，明顯黏液膿血便，體溫在37.5℃以上，脈搏在90次／分及以上，血紅蛋白小于100g／L，血沉大于30mm／h。內(nèi)鏡分級參考改良的Baron分級標(biāo)準(zhǔn)：0級為黏膜正常；Ⅰ級為黏膜充血，血管模糊；Ⅱ級為黏膜有接觸性出血；Ⅲ級為黏膜有自發(fā)性出血；Ⅳ級為黏膜可見大小不等的潰瘍［3］。

1.3 方法 用藥：第一組，四聯(lián)活菌片（杭州龍達(dá)新科生物制藥有限公司，規(guī)格每粒0.5g）3粒／次，每天3次。同時口服本院自制中藥芪倍合劑（新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，規(guī)格每瓶100mL，每次50mL，每天2次）；第二組服用四聯(lián)治菌片，劑量同第一組；第三組服用芪倍合劑，劑量同第一組。以3個月為1個療程，觀察并記錄療效及不良反應(yīng)。療效判斷：參照《臨床疾病診斷依據(jù)治愈好轉(zhuǎn)標(biāo)準(zhǔn)》［4］和《中藥新藥臨床研究指導(dǎo)原則（試行）》［5］制訂。痊愈：臨床癥狀消失，腸鏡檢查、腸黏膜檢查恢復(fù)正常。好轉(zhuǎn)：臨床癥狀減輕，腸鏡檢查、腸黏膜病變較前明顯改善，大便常規(guī)檢查有少量紅、白細(xì)胞。無效：治療前后，臨床癥狀和鏡檢等檢查無改善或無明顯改善?？傆行剩剑ㄈ龜?shù)＋好轉(zhuǎn)例數(shù)）／總例數(shù)×100%。外周血淋巴細(xì)胞Fas及FasL的定量檢測及T細(xì)胞亞群分類檢測：采靜脈血3mL，肝素抗凝，離心取血清，用美國Coulter EPICS XL型流式細(xì)胞儀對3組病例治療前、后及健康對照組進(jìn)行外周血淋巴細(xì)胞Fas、FasL表達(dá)水平的定量檢測及T細(xì)胞亞群分類檢測。試劑異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記CD95單克隆抗體、FITC標(biāo)記Fas配體單克隆抗體及FITC標(biāo)記小鼠IgG1同型對照抗體購自法國Immunotech公司。

1.4 不良反應(yīng) 觀察有無胃腸道癥狀（如惡心、嘔吐、食欲不振、腹瀉等）和其他不良反應(yīng)情況。

1.5 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料用表示，采用t檢驗，計數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 臨床療效比較 四聯(lián)活菌片聯(lián)合芪倍合劑組總有效率達(dá)92.50%，各組臨床療效見表1。

2.2 外周血T細(xì)胞亞群檢測結(jié)果 各組治療前外周血T細(xì)胞（CD3＋）、輔助性 T 細(xì)胞（CD3＋CD4＋）、抑制性 T 細(xì)胞（CD3＋CD8＋）均高于健康對照組（P＜0.01），CD4＋／CD8＋比值下降（P＜0.01）；各組治療后 CD3＋、CD3＋CD4＋、CD4＋CD8＋均較治療前下降（P＜0.05），CD4＋／CD8＋值也下降（P＜0.05），見表2。

表1 各組臨床療效比較

表2 各組治療前后外周血T細(xì)胞亞群檢測結(jié)果（）

表2 各組治療前后外周血T細(xì)胞亞群檢測結(jié)果（）

a：P＜0.05、b：P＜0.01，與健康對照組比較；c：P＜0.05、d：P＜0.01，與同組治療前比較。

組別 n 時間 CD3＋ CD3＋CD4＋ CD3＋CD8＋ CD4＋／CD8＋值第一組 40 治療前 68.65±5.15b 34.88±8.97b 21.76±5.19b 1.86±0.38b治療后 63.61±8.25d 33.68±7.96d 20.56±5.09d 1.57±0.66d第二組 40 治療前 65.91±5.05b 32.98±7.67b 21.76±5.29b 1.76±0.58b治療后 63.55±9.05d 33.54±6.88a 20.45±4.59a 1.45±0.56第三組 40 治療前 67.51±5.10a 35.48±5.65b 22.66±4.79a 1.66±0.58a治療后 62.54±7.65d 32.78±7.65c 22.76±8.97c 1.35±0.56c健康對照組 40 63.91±5.35 33.88±9.97 20.76±6.19 1.58±0.88

表3 各組治療前后外周血淋巴細(xì)胞Fas及FasL的表達(dá)情況（）

表3 各組治療前后外周血淋巴細(xì)胞Fas及FasL的表達(dá)情況（）

組別 n 時間Fas FasL第一組 40治療前 48.54±14.46b 1.27±0.69治療后 35.78±12.19d 1.09±1.20第二組 40治療前 42.38±12.45b 1.18±1.35治療后 36.55±13.34c 1.17±1.26

續(xù)表3 各組治療前后外周血淋巴細(xì)胞Fas及FasL表達(dá)情況（）

續(xù)表3 各組治療前后外周血淋巴細(xì)胞Fas及FasL表達(dá)情況（）

a：P＜0.05、b：P＜0.01，與健康對照組比較；c：P＜0.05、d：P＜0.01，與同組治療前后比較。

組別 n 時間Fas FasL第三組 40治療前 43.96±11.97b 40 38.55±9.99 1.18±1.251.27±1.24治療后 35.83±12.86ac 1.11±1.76健康對照組

2.3 外周血淋巴細(xì)胞Fas及FasL檢測結(jié)果 與健康對照組比較，各組治療前外周血淋巴細(xì)胞Fas表達(dá)明顯升高（P＜0.01），治療后Fas較治療前明顯下降（P＜0.01），見表3。

2.4 不良反應(yīng) 第一組有2例出現(xiàn)惡心不適，第三組1例出現(xiàn)腹瀉加重，其余均無不良反應(yīng)發(fā)生。

3 討 論

UC的病因和發(fā)病機制尚未明確，被 WHO列為疑難?。?］之一。它的病因和發(fā)病機制與免疫功能紊亂有密切的聯(lián)系［7］。Th1／Th2亞群平衡失調(diào)可能參與UC發(fā)?。?］，多認(rèn)為是一種自身免疫性疾病，多種細(xì)胞因子［如IL、γ－干擾素、TNF、轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）等］和炎性介質(zhì)（白細(xì)胞三烯、血栓素、組胺、前列腺素等）參與UC的發(fā)生發(fā)展，引起組織破壞及炎性改變，具有較高的遺傳傾向［9］。由于其發(fā)病機理涉及多因素多環(huán)節(jié)相互作用，其治療是綜合的［10－11］。由于西藥治療本病存在毒副作用多、病情反復(fù)等［12］缺點，采用中醫(yī)藥治療越來越受到醫(yī)學(xué)界的關(guān)注。UC治療原則為盡早控制癥狀，維持緩解，預(yù)防復(fù)發(fā)，防治并發(fā)癥。因其病程遷延不愈，長達(dá)十幾年甚至幾十年亦有發(fā)生癌變的可能性［13］。流行病學(xué)資料提示UC的發(fā)病率在國內(nèi)和國外都有逐年增高的趨勢［14－15］，可能與人們生活習(xí)慣、生活方式的變化、城市環(huán)境改變以及醫(yī)療水平的提高等有關(guān)。微生態(tài)制劑四聯(lián)活菌片為新型免疫調(diào)節(jié)劑，可誘導(dǎo)Th1反應(yīng)，對外周血CD4＋T細(xì)胞亞群有一定的直接刺激作用，有助于調(diào)節(jié)和恢復(fù)體內(nèi)Th1／Th2平衡，使CD4＋／CD8＋比值處于正常范圍。本研究表明，UC患者外周血T淋巴細(xì)胞亞群及Fas／FasL系統(tǒng)表達(dá)明顯升高，這與文獻(xiàn)報道的結(jié)果一致。芪倍合劑（豫藥制字Z04070018）是本院中藥制劑室研制的純中藥制劑具有健脾益腎、澀腸止瀉之功效。處方中黃芪補氣升陽、行滯通痹，五倍子澀腸止瀉，大黃瀉下攻積，附子散寒止痛，白及收斂止血，赤石脂斂瘡生肌，諸藥合用，相輔相成，具有健脾益腎、澀腸止瀉之功效。近年來研究表明，黃芪、附子、干姜都具有免疫調(diào)節(jié)作用，大黃有消炎及免疫調(diào)節(jié)和使局部血管收縮的止血作用，五倍子能使黏膜、潰瘍等局部組織蛋白凝固而呈現(xiàn)收斂作用，能加速血液凝固止血，對多種細(xì)菌均有明顯抑制和殺滅作用，赤石脂能吸附消化道的毒物和炎癥滲出物，使炎癥得以緩解。有研究報道芪倍合劑能顯著降低大鼠模型結(jié)腸組織促炎細(xì)胞因子、TNF－α、IL－8水平，表明其能抑制促炎細(xì)胞因子的分泌，調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，減少炎癥遞質(zhì)的釋放，從而有效阻斷免疫反應(yīng)性對機體造成的損傷，達(dá)到治療的目的。研究表明在活動性UC病變區(qū)域或炎癥附近的區(qū)域的上皮細(xì)胞和保護性免疫細(xì)胞發(fā)生凋亡的程度和范圍都高于正常組織，且導(dǎo)致這種大量凋亡是通過Fas／FasL途徑完成的。Fas／FasL在結(jié)腸上皮細(xì)胞內(nèi)的信號主要的是通過半胱天冬蛋白酶caspase介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的，caspase可通過裂解細(xì)胞角蛋白18等引導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)生。

本研究通過對微生態(tài)制劑聯(lián)合芪倍合劑治療UC，無論在臨床療效還是各項指標(biāo)的改善上均優(yōu)于健康對照組，總有效率達(dá)92.5%，明顯高于四聯(lián)合菌片單獨治療（P＜0.01）。CD3＋、CD3＋CD4＋、CD3＋CD8＋較治療前降低（P＜0.05），CD4＋／CD8＋比值降低（P＜0.05），F(xiàn)as明顯下降（P＜0.01），表明四聯(lián)合菌片在芪倍合劑的協(xié)同作用下，通過調(diào)整機體細(xì)胞免疫功能，提高UC的療效。

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