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    比格犬ERβ剪切異構(gòu)體ERβ419沉默表達(dá)載體的構(gòu)建及篩選

    2014-08-14 07:54:54趙彥斌陳福軍孫兆增胡仲明楊煥民
    中國比較醫(yī)學(xué)雜志 2014年11期
    關(guān)鍵詞:離心管培養(yǎng)基子宮

    甘 藝,趙彥斌,陳福軍,孫兆增,胡仲明,劉 冰,楊煥民,曾 林

    (1.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)動物科技學(xué)院,黑龍江 大慶 163319;2.實驗動物中心,北京 100071;3.五棵樹經(jīng)濟(jì)開發(fā)區(qū)動物衛(wèi)生監(jiān)督所,長春 130401)

    比格犬ERβ419為該犬最新發(fā)現(xiàn)的ERβ剪切異構(gòu)體,尚無其生物學(xué)功能的報道。ERβ419 cDNA序列由下丘腦-垂體-性腺軸提純得到,ERβ419由1257個堿基組成,編碼419aa,命名為ERβ419。研究未知基因的生物學(xué)功能通常借助于慢病毒介導(dǎo)RNAi重組載體,本實驗旨在篩選最有效的沉默表達(dá)載體,為后續(xù)探索比格犬ERβ419的生物學(xué)功能提供試驗材料。

    1 材料和方法

    1.1 材料

    1.1.1 主要試劑:

    無內(nèi)毒素質(zhì)粒小提試劑盒、GenFectinTM基因轉(zhuǎn)染試劑、為Biomed品牌產(chǎn)品,4×SDS上樣緩沖液為Solarbio品牌產(chǎn)品,胎牛血清、DMEM高糖培養(yǎng)基為Hyclone品牌產(chǎn)品,0.25%EDTA胰酶、PBS緩沖液、1 mol/L Tris-Cl、1.5 mol/L Tris-Cl為Solarbio品牌產(chǎn)品、抗MYC標(biāo)簽兔單克隆抗體(GTX115046)為GENETEX品牌產(chǎn)品,抗GAPDH兔多克隆抗體(CW0101)、HRP標(biāo)記兔二抗(CW0103)為康為品牌產(chǎn)品,DMSO為Invitrogen品牌產(chǎn)品,G418為Gibco品牌產(chǎn)品,T4 DNA Ligase和PrimeScript RT reagent Kit,SYBR?Premix Ex TaqTMII是TaKaRa品牌產(chǎn)品,胰蛋白胨、NaCl、酵母粉、脫脂奶粉等均為國產(chǎn)試劑。

    1.1.2 菌種及細(xì)胞株:

    pcDNA3.1-MYC-ERβ419重組質(zhì)粒菌液及質(zhì)粒、pGLV3/H1/GPF+Puro載體和HEK293T細(xì)胞由本實驗室凍存。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 穩(wěn)定表達(dá)ERβ419蛋白細(xì)胞株的構(gòu)建

    1.2.1.1 構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)ERβ419基因的細(xì)胞株

    將細(xì)胞計數(shù)后適宜數(shù)量接種于6孔板中,高糖DMEM完全培養(yǎng)基(含有10%FBS,無雙抗)培養(yǎng)18~22 h。細(xì)胞鋪板底70%~80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將4 μg pcDNA3.1-Myc-ERβ419重組質(zhì)粒及10 μL GenFectinTM基因轉(zhuǎn)染試劑分別稀釋于50 μL 0.15 mol/L NaCl中,兩者再輕柔混合,室溫靜置5 min,混合液加入6孔板培養(yǎng)基中,培養(yǎng)24 h。

    將瞬時轉(zhuǎn)染的細(xì)胞以適當(dāng)倍數(shù)稀釋于100 mm細(xì)胞培養(yǎng)皿中,并設(shè)對照組細(xì)胞(同等數(shù)量的HEK293T細(xì)胞);待細(xì)胞貼壁,并鋪至瓶底50%~70%時,加入含有青鏈霉素濃度為100 μg/ mL和G418濃度為800 μg/ mL的篩選培養(yǎng)基;每2~3日更換一次篩選培養(yǎng)基;待對照組細(xì)胞全部死亡,挑取單克隆細(xì)胞至96孔板中用完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng);每2~3 d更換一次半濃度篩選培養(yǎng)基;篩選28 d后,可見有抗性的細(xì)胞團(tuán)未發(fā)生死亡,生長狀態(tài)良好,即可停藥,擴(kuò)大培養(yǎng);當(dāng)細(xì)胞量達(dá)到一定數(shù)量時,即可檢測目的蛋白的表達(dá)。

    1.2.1.2 蛋白質(zhì)印跡法檢測目的重組真核表達(dá)載體在HEK293T 細(xì)胞中的表達(dá)

    收集待測細(xì)胞于離心管,每管加入500 μL 細(xì)胞裂解液,4℃全速離心30 min;取上清,用BCA法測定上清蛋白濃度;加適量4×SDS上樣緩沖液;沸水浴10~15 min,待10%SDS-PAGE膠干后,每個膠孔加入等質(zhì)量蛋白;恒電壓電泳;蛋白膠恒電流轉(zhuǎn)印至0.45 μm PVDF膜;蛋白膜用5%脫脂奶粉封閉0.5~1 h后,按實驗需要剪裁蛋白膜;目的蛋白膜放入抗Myc標(biāo)簽兔單抗1:1000稀釋液,GAPDH蛋白膜放入抗GAPDH兔多克隆抗體1:5000稀釋液,孵育4℃過夜;TBST洗膜3次,每次7 min;加入HRP標(biāo)記兔二抗1:3000稀釋液,室溫孵育1 h;TBST洗膜3次,每次7 min;待目的蛋白膜和GAPDH蛋白膜半干后,按原位置拼接,逐滴添加發(fā)光試劑盒A/B液等體積混合液,反應(yīng)1 min,去除混合液后,即可顯影。

    1.2.2 針對ERβ419基因慢病毒介導(dǎo)RNAi重組載體的構(gòu)建

    1.2.2.1 ERβ419基因shRNA序列的設(shè)計

    依據(jù)siRNA設(shè)計原則,選擇ERβ419基因CDs序列為RNAi靶序列,在(網(wǎng)址http://www.lifetechnologies.com/cn/zh/home/life-science/rnai.html)上針對每條目的基因設(shè)計出三對互補(bǔ)的siRNA模板序列,以5’-TTCAAGAGA-3’為發(fā)夾狀,每個基因設(shè)計三條特異性shRNA環(huán)形序列,并采用Blast軟件對選擇的三條靶序列進(jìn)行同源分析,排除shRNA特異性地抑制其他基因片段的可能。再在shRNA堿基序列的5‘端和3’端分別加入限制性內(nèi)切酶BamHI和EcoRI的酶切位點,最后將shRNA序列插入pGLV3/H1/GPF載體中;三條shRNA的寡核苷酸,分別為:

    shRNAl:5’-GATCCgctgtgatgaattacagtaTTCAAGA GAtactgtaattcatcacagcTTTTTTG-3’;shRNA2:5’-GAT CCggtcgtgtgaaggatgtaaTTCAAGAGAttacatccttcacacgacc TTTTTTG-3’;shRNA3:5’-GATCCgctcttggcaacaacttca TTCAAGAGAtgaagttgttgccaagagcTTTTTTG-3’;shNC:5’-GATCCGttctccgaacgtgtcacgtTTCAAGAGAacgtgacac gttcggagaaCTTTTTTG-3’。將構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒送往江蘇吉瑪生物公司合成慢病毒,病毒滴度為108。

    1.2.2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染病毒復(fù)數(shù)值(MOI值)的測定

    將HEK293T細(xì)胞按3×103/孔細(xì)胞量接種于96孔板中;空白對照和實驗組分組鋪板后,添加無青鏈霉素的完全培養(yǎng)基至150 μL,培養(yǎng)18~22 h;取干凈1.5 mL離心管4支,分別加入90 μL新鮮完全培養(yǎng)基。向第1支離心管添加10 μL病毒原液,混勻后吸取10 μL加入第2支離心管中,以此類推,4支離心管中慢病毒濃度依次稀釋10倍,混合均勻;棄廢液,加入預(yù)混稀釋后的病毒液,空白對照組加入100 μL完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h;棄舊病毒液,加入150 μL 完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)48 h;在熒光顯微鏡下觀察侵染細(xì)胞的熒光效率,并計算慢病毒的MOI值。

    1.2.3 實時熒光定量PCR和Western Blot檢測ERβ419 RNAi慢病毒重組載體的干涉效率

    1.2.3.1 引物熒光定量PCR特異性設(shè)計

    根據(jù)GenBank中β-actin(AF021873)基因和比格犬ERβ剪切異構(gòu)體ERβ419編碼區(qū)序列,利用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計,并且通過NCBI中Blast序列比對功能,初步檢測引物的特異性。引物由北京Biomed生物技術(shù)公司合成。

    1.2.3.2 慢病毒侵染目的基因穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系

    按照2×105個/孔將穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞均勻鋪至細(xì)胞6孔板中,實驗分為正常培養(yǎng)組,無關(guān)序列組,shRNA1組,shRNA2組,shRNA3組。每孔加入完全培養(yǎng)基至2 mL,培養(yǎng)18~24 h;取干凈1.5 mL離心管4支,吸取1 mL新鮮完全培養(yǎng)基,加入適量病毒原液,混合均勻,棄實驗組舊培養(yǎng)基,加入病毒稀釋液,正常培養(yǎng)基組加入同等體積的完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)24 h;棄廢病毒稀釋液,加入2 mL完全培養(yǎng)基,培養(yǎng)36 h;根據(jù)實驗需要,采用適當(dāng)?shù)脑囼灧椒?,處理侵染慢病毒的靶?xì)胞。

    1.2.3.3 慢病毒侵染目的基因穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞RNA的提取

    用于提取RNA的耗材、塑料器皿均經(jīng)0.1 % DEPC水浸泡24 h,高壓滅菌處理,氯仿、異丙醇及75%乙醇4℃預(yù)冷,6孔板中每孔加入1 mL Trizol,反復(fù)吹打細(xì)胞,將細(xì)胞-Trozol混合液收集用移液槍吸出,轉(zhuǎn)入1.5 mL離心管中,冰上放置5~10 min;加入0.2 mL氯仿,劇烈震蕩30 s,冰上放置10 min;12 000 g,4℃低溫離心15 min;將上層水相轉(zhuǎn)入新的1.5 mL離心管中,加入0.5 mL異丙醇,輕輕上下顛倒混勻,冰上放置10 min;12 000 g,4℃低溫離心15 min;棄上清,加入1 mL預(yù)冷的75%乙醇,用1 mL移液器吹起沉淀;7 500 g,4℃低溫離心5 min;棄去乙醇并瞬時離心,小心吸棄并蒸發(fā)管內(nèi)液體;加入預(yù)冷的適量0.1% DEPC處理水溶解總RNA;儀器測定 A260/A280 吸光度,定量總 RNA 的濃度和純度。取1 μg RNA混合液加入0.1% DEPC 處理水配制的1%瓊脂糖凝膠槽中,150 V,10 min,檢測總RNA的完整性;根據(jù)實驗需要適當(dāng)用0.1% DEPC 處理水稀釋 RNA。

    1.2.3.4 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)

    按照PrimeScript RT reagent Kit(TaKaRa)試劑盒的說明書在冰上配制操作。反應(yīng)條件為37 ℃ 30 min,85 ℃ 5 s,所得cDNA于-20℃保存。

    1.2.3.5 實時熒光定量PCR(qPCR)檢測RNAi重組慢病毒載體干涉效果

    按照SYBR?Premix Ex TaqTMII(TaKaRa)試劑的說明書在冰上配制操作。反應(yīng)條件為預(yù)變性 95 ℃ 30 s;變性 95 ℃ 5 s,退火 58 ℃(β-actin)20 s/ 55 ℃(ERβ419)20 s,40個循環(huán)。融解曲線條件為95 ℃ 1 min;55 ℃ 1 min;55 ℃~94.6 ℃(每隔0.3℃采集一次熒光信號)循環(huán)133次,每組的樣本均設(shè)3次重復(fù);反應(yīng)結(jié)束后,軟件自動導(dǎo)出擴(kuò)增動力學(xué)曲線、融解曲線和循環(huán)閾值(cycle threshold,Ct值),由融解曲線判定PCR反應(yīng)的特異性,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線以及熒光曲線的Ct值計算定量結(jié)果。使用SPSS17.0統(tǒng)計軟件處理實驗數(shù)據(jù),得到三條干涉序列對目的基因mRNA的抑制效果。

    所有的樣品同期做三次重復(fù),數(shù)值以x±s表示。標(biāo)準(zhǔn)曲線反應(yīng)結(jié)果由IQ5儀器自動收集、分析和導(dǎo)出。自動顯示內(nèi)參基因和目的基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、擴(kuò)增效率R2以及直線方程系數(shù)(斜率)。

    1.2.3.6 Western Blot技術(shù)檢測ERβ419 RNAi重組慢病毒載體干涉效果

    方法同1.2.1.2操作步驟。通過Photoshop 7.0繪圖軟件對五組實驗組蛋白表達(dá)量差異進(jìn)行分析。每組蛋白進(jìn)行三次灰度分析,所得數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS17.0處理。

    2 結(jié)果

    2.1 篩選ERβ419陽性克隆細(xì)胞

    經(jīng)過長達(dá)28 d的G418篩選培養(yǎng)基的篩選,出現(xiàn)陽性克隆細(xì)胞。挑取至96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,利用半濃度G418篩選培養(yǎng)基的連續(xù)培養(yǎng),細(xì)胞能夠正常生長,狀態(tài)良好,不再死亡,即為陽性克隆細(xì)胞。

    2.2 Western Blot方法檢測ERβ419陽性克隆細(xì)胞中表達(dá)

    Western Blot結(jié)果顯示,pcDNA3.1-MYC-ERβ419(列1)編碼蛋白質(zhì)在HEK293T細(xì)胞中的的分子量大小為47×103,證明目的蛋白穩(wěn)定且高效表達(dá)(圖1)。

    注:1:pcDNA3.1-MYC-ERβ419;2:HEK293T細(xì)胞。

    2.3 qRT-PCR和Western Blot檢測ERβ419干涉序列在mRNA水平和蛋白水平的定量分析

    通過IQ5熒光定量PCR儀自帶軟件的數(shù)據(jù)和Photoshop 7.0灰度分析軟件,結(jié)合SPSS17.0分析軟件得到以下數(shù)據(jù)(表2.1),表明,ERβ419-shNC(P> 0.05)、ERβ419-shRNA2(P> 0.05)、ERβ419-shRNA1(P< 0.01)和ERβ419-shRNA3(P< 0.01)差異極顯著,ERβ419-shRNA3的干涉效果最優(yōu)。

    表1 不同實驗組目的基因mRNA和蛋白的表達(dá)情況

    3 討論

    ERs首先是在哺乳動物體內(nèi)的生殖系統(tǒng)器官中發(fā)現(xiàn),并研究其對機(jī)體生殖生理的影響。隨著研究方向的拓展和研究內(nèi)容的深入,ERs的生物學(xué)功能已不再單純的只作用于生殖系統(tǒng),在骨骼、中樞伸進(jìn)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)、內(nèi)分泌系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等方面也有涉及,對腫瘤的發(fā)生發(fā)展也有一定的影響。

    ERs的高表達(dá)除了刺激生殖器官的發(fā)育和維持第二性征外,也可有效降低血液中的血脂含量,促進(jìn)其恢復(fù)到正常水平,促進(jìn)血管平滑肌松弛,降低血壓、保護(hù)心肌[1-2],抑制自由基對機(jī)體傷害,直接和間接影響胰島素功能,調(diào)節(jié)血糖,有效預(yù)防阿爾茲海默病、帕金森病及骨質(zhì)疏松癥等疾病[3-7]。

    但ERs的高表達(dá)對機(jī)體也有負(fù)面影響,一些生殖系統(tǒng)方面的疾病都是因此而發(fā)生的。主要發(fā)生在卵巢、子宮和胸腺等實質(zhì)器官。卵巢產(chǎn)生卵細(xì)胞和雌激素。卵巢分泌的雌激素與靶細(xì)胞上相應(yīng)受體接觸和結(jié)合,激活有絲分裂原相關(guān)的生物學(xué)效應(yīng),誘導(dǎo)靶器官功能性亢進(jìn),最終導(dǎo)致卵巢疾病的發(fā)生[8]。卵巢癌變成為了最終且最惡劣的結(jié)果,其發(fā)病機(jī)制與雌激素信號通路有關(guān)。子宮作為雌激素調(diào)控的靶器官之一,其內(nèi)膜細(xì)胞在妊娠期和發(fā)情周期發(fā)生周期性的增生和脫落。靶細(xì)胞受雌激素-ERs復(fù)合物的協(xié)同調(diào)節(jié)。實驗證明,對于子宮的發(fā)育及功能而言,ERs的正常表達(dá)尤為重要,但其異常激活對子宮的正常發(fā)育產(chǎn)生影響[9]。子宮內(nèi)膜異位癥、子宮內(nèi)膜腺癌、子宮肌瘤等疾病成為與ERβ相關(guān)的熱點子宮疾病。子宮肌瘤細(xì)胞內(nèi)ERs和E2含量均較正常肌組織高,較高含量的雌激素刺激子宮肌瘤內(nèi)的較高表達(dá)的ERs,導(dǎo)致子宮肌瘤的快速增生。乳腺組織中的血管分布密集,使不同時期分泌量不斷變化的雌激素到達(dá)間質(zhì)組織、脂肪組織及上皮細(xì)胞腺狀體等靶細(xì)胞,進(jìn)而在青春期、月經(jīng)周期和妊娠期不同生理期,完成乳腺的激素調(diào)節(jié)和生理功能。雌激素信號通路誘導(dǎo)乳腺細(xì)胞增殖和凋亡等功能,乳腺癌形成則因該信號通路異常導(dǎo)致[10-12]。

    RNAi因針對特定基因高效沉默其表達(dá)而通常應(yīng)用于未知基因生物學(xué)功能的研究,成為現(xiàn)今研究基因生物學(xué)功能的重要工具??茖W(xué)家們試圖通過調(diào)節(jié)雌激素或ERs的表達(dá)而起到預(yù)防和治療疾病的效果。RNAi技術(shù)就是一種極佳的臨床治療辦法。主要是設(shè)計針對致病基因或誘導(dǎo)致病基因mRNA的干涉序列,通過特異性dsRNA的靶向作用,沉默目的基因的表達(dá),從而抑制了疾病的發(fā)生發(fā)展。試驗方法上便于操作,且高效持久,技術(shù)成熟。

    比格犬雌性生殖系統(tǒng)方面常會出現(xiàn)繁殖能力下降、生殖器官病變等諸多問題,其主要原因是下丘腦-腦垂體-性腺軸中雌激素正負(fù)反饋調(diào)節(jié)機(jī)制發(fā)生異常。這種機(jī)制也受到ERs的表達(dá)量、表達(dá)水平與表達(dá)時間的調(diào)控[13-15]。ERs選擇性剪切機(jī)制產(chǎn)生的剪切異構(gòu)體增加了蛋白質(zhì)組多樣性,使雌激素信號在比格犬的生殖生理中發(fā)揮多種調(diào)節(jié)作用,了解ERs剪切異構(gòu)體的生理學(xué)功能成為改善該犬生殖系統(tǒng)功能異常的研究重點。

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