復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因水稻B2A68在南京地區(qū)雜草化的風險評估

黃 鷂，王 建，戴偉民，強 勝，肖國櫻，宋小玲

(1.南京農(nóng)業(yè)大學雜草研究室，江蘇南京 210095；2.中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，湖南長沙 410125)

復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因作物指同一植株中含有2個或2個以上的轉(zhuǎn)基因性狀或轉(zhuǎn)化體的作物[1]。復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因作物具有明顯的優(yōu)勢，在擁有更廣闊的農(nóng)藝性狀以適應(yīng)非適宜環(huán)境的同時，還可以提高產(chǎn)量[2-3]。在所有復(fù)合性狀中，抗除草劑性狀與抗蟲性狀是主要的復(fù)合性狀，成為將來轉(zhuǎn)基因作物發(fā)展的一個重要方向。

植物雜草化(weediness)是指原本自然分布的栽培植物，在新的人工生境中能自然繁殖其種群而轉(zhuǎn)變?yōu)殡s草的演化過程。轉(zhuǎn)基因作物由于插入抗蟲、抗病、抗除草劑等基因，具有了更強的適應(yīng)性，在生長勢、越冬性、種子產(chǎn)量和種子越冬能力等方面可能比非轉(zhuǎn)基因植株強，入侵性提高，從而占據(jù)其他植物的棲息地，影響生物多樣性，破壞自然種群平衡。盡管從目前的研究來看，單一性狀的轉(zhuǎn)基因水稻在生存競爭能力、自生苗以及越冬能力等方面與非轉(zhuǎn)基因受體以及當?shù)爻Ｒ?guī)水稻相比無明顯區(qū)別，且雜草化的風險較小[4]。但由于復(fù)合性狀的轉(zhuǎn)基因作物轉(zhuǎn)入了2個外源基因，外源基因引起的轉(zhuǎn)基因作物生存競爭能力的改變可能比單一性狀的轉(zhuǎn)基因更為復(fù)雜。

現(xiàn)有的報道都是針對單一性狀轉(zhuǎn)基因作物的生存競爭能力，如宋小玲等對孟山都公司的轉(zhuǎn)基因大豆進行了雜草化研究，發(fā)現(xiàn)抗草甘膦轉(zhuǎn)基因大豆在江蘇省南京地區(qū)演化為雜草的可能性較小[5]；崔榮榮等對抗草銨膦轉(zhuǎn)基因水稻明恢86B進行了雜草化評估，發(fā)現(xiàn)明恢86B演化為雜草的可能性不大[4]；陳小文等比較了轉(zhuǎn)Cyr1Ac基因的抗蟲玉米及其受體在荒地中的生存競爭情況，發(fā)現(xiàn)該轉(zhuǎn)基因玉米品種演化為超級雜草的可能性很小[6]；張興華等對轉(zhuǎn)雙價抗蟲棉進行了生存能力競爭研究，發(fā)現(xiàn)抗蟲棉的生存競爭能力強于其非轉(zhuǎn)基因受體[7]。但鮮有復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因作物的相關(guān)報道。

本研究以轉(zhuǎn)Cry2Aa#和轉(zhuǎn)Bar基因的抗蟲抗除草劑轉(zhuǎn)基因水稻B2A68為供試材料[8]，探索復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因水稻的雜草化潛力，以期為該復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因水稻的安全性評估提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

轉(zhuǎn)基因水稻B2A68：由湖南雜交水稻研究中心提供，該水稻攜帶單拷貝的抗蟲基因Cry2Aa#與抗除草劑草銨膦的Bar基因，受體水稻為早稻D68。

轉(zhuǎn)基因水稻Bar68-1：轉(zhuǎn)入抗除草劑草銨膦Bar基因，其親本受體同上，由香港中文大學、湖南雜交水稻研究中心與中國科學院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所合作培育。

當?shù)爻Ｒ?guī)稻：寧粳46，粳型。

1.2 方法

1.2.1 試驗基地概況 試驗在南京農(nóng)業(yè)大學雜草研究室轉(zhuǎn)基因水稻安全性評估試驗基地進行。土壤pH值大于6小于7，偏酸性，肥力良好、排灌情況良好。試驗地栽培管理按當?shù)爻Ｒ?guī)栽培方式播種后，不加以其他管理措施。試驗期間無影響整個試驗結(jié)果的惡劣氣候因素，試驗地設(shè)專人看管，設(shè)圍攔以防止人為或動物破壞。需要收獲的轉(zhuǎn)基因水稻材料單獨收獲、單脫、單藏，由專業(yè)技術(shù)人員專人運輸和保管。檢測試驗完畢后，除需要保留的材料外，剩余的轉(zhuǎn)基因試驗材料一律燒毀。試驗地四周有 2 m 高的圍欄，100 m范圍內(nèi)無水稻種植，符合國家相關(guān)規(guī)定。

1.2.2 轉(zhuǎn)基因水稻生存競爭力試驗

1.2.2.1 試驗設(shè)計 處理1：直播。采用3種種植密度即高密度(300粒/m2)、中密度(150粒/m2)、低密度(75粒/m2)，小區(qū)面積為4 m2(2 m×2 m)。分4期播種，適宜期2期，分別為2012年6月19日(Ⅰ)和2012年6月29日(Ⅱ)；非適宜期2期，分別為2012年7月9日(Ⅲ)和2012年7月20日(Ⅳ)。每處理4次重復(fù)，采用隨機區(qū)組排列。

處理2：移栽。用25～30 d秧苗單株移栽，株距20 cm，行距20 cm。小區(qū)面積6.8 m2(2 m×3.4 m)，各處理隨機排列。

1.2.2.2 調(diào)查內(nèi)容 雜草調(diào)查：采用對角線5點取樣法，直播方式播種的樣方面積為0.1 m2，移栽方式的樣方面積為1 m2。在播種后30、60 d調(diào)查記錄每小區(qū)雜草種類、株數(shù)，按雜草垂直投影面積占小區(qū)面積的比例估算出雜草的相對覆蓋率。

競爭力調(diào)查：直播方式在播種后10 d、移栽方式在水稻移栽后15 d調(diào)查記錄每小區(qū)的水稻株數(shù)及成苗率，以后每隔15 d每小區(qū)隨機調(diào)查10株長勢最好的水稻，測量其主莖株高、分蘗數(shù)。

1.2.3 轉(zhuǎn)基因水稻繁殖能力

1.2.3.1 試驗設(shè)計 本試驗的田間試驗設(shè)計同“1.2.2”部分，在生存競爭力試驗田中進行。

1.2.3.2 調(diào)查內(nèi)容 花粉活力檢測：每小區(qū)隨機取10株水稻，每株水稻取3朵小花。采用常規(guī)I2-KI染色法進行檢測。

生殖生長指標統(tǒng)計：水稻成熟后每小區(qū)采收10株長勢最好的水稻，統(tǒng)計每株主穗的穗長、每穗飽粒數(shù)、每穗總粒數(shù)、落粒數(shù)、地上部生物量，并計算出結(jié)實率(結(jié)實率=每穗飽粒數(shù)/每穗總粒數(shù)×100%)和落粒率，落粒率的檢測及計算參照崔榮榮等的方法[4]，落粒率水平參照應(yīng)存山的方法[9]。

1.2.4 自生苗和再生苗 在生存競爭力試驗的同一塊田中進行。除繁殖力考察中每小區(qū)采收10株水稻外，其余水稻均不收割，讓其自然落在土壤中，田塊冬季閑置，不進行任何管理。在收完需考察的水稻后，每隔20 d調(diào)查一次試驗小區(qū)內(nèi)的自生苗和再生苗情況，共調(diào)查2次，并在翌年當?shù)厮痉痔Y期后調(diào)查一次自生苗和再生苗。通過考察轉(zhuǎn)基因水稻作物演化成自生苗的比例，評價轉(zhuǎn)基因水稻的自然延續(xù)能力。對出現(xiàn)的自生苗取樣后帶回實驗室驗證，調(diào)查結(jié)束后翻耕。

1.2.5 種子生存能力

1.2.5.1 種子萌發(fā)試驗 水稻種子收回后30 d按GB/T 3543.4—1995《農(nóng)作物種子檢驗規(guī)程 發(fā)芽試驗》規(guī)定的方法檢測發(fā)芽率。

1.2.5.2 種子埋藏試驗 種子埋藏試驗于2013年1月20日進行，按隨機區(qū)組試驗設(shè)計，設(shè)淺埋(3 cm)和深埋(20 cm)2種埋藏深度。取待測種子25粒裝于200目的尼龍網(wǎng)袋中，4次重復(fù)，埋藏地點在水稻生存競爭力試驗田，并分別于埋后2、4、6個月取出種子進行種子萌發(fā)試驗，并統(tǒng)計已腐爛數(shù)。不能萌發(fā)的種子用TTC法檢測種子是否有活力。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜草調(diào)查結(jié)果

直播稻田播后30 d時第Ⅰ期和第Ⅱ期雜草發(fā)生量很大，主要是異型莎草(CyperusdifformisLinn.)、稗草[Echinochloacrusgalli(L.) Beauv.]、水莧菜(AmmanniabacciferaLinn.)，占雜草發(fā)生量的65%，其次還有少量的鴨舌草[Monochoriavaginalis(Burm. f.)C. Presl]、四葉萍[MarsileaquadrifoliaL.(E)pepper Wort]、水虱草[Fimbristylismiliaceae(L.)Vahl.]、節(jié)節(jié)菜[Rotalaindica(Willd.) Koehne]。同一水稻品種，高密度播種方式下的雜草量略低于低密度下的雜草量，但總體上來說，B2A68、Bar68-1和常規(guī)稻的小區(qū)雜草數(shù)量沒有顯著差異。第Ⅰ期、第Ⅱ期總草覆蓋率在45%～65%。播后 60 d 時，千金子大量發(fā)生，占總草的50%以上，千金子與水稻的高度比約為1.6 ∶1，總草覆蓋率達到80%。

直播第Ⅲ期和第Ⅳ期，各小區(qū)雜草發(fā)生量差異不顯著，播后30 d雜草發(fā)生量較第Ⅰ期和第Ⅱ期少，主要雜草為千金子和異型莎草，占總草的44%左右，其次還有少量的水虱草、節(jié)節(jié)菜等，總草覆蓋率為56%～60%。播后60 d時，千金子成為主要的雜草，占總草的60%以上，總草覆蓋率約為70%。

移栽水稻田移栽后30 d雜草與直播水稻相比發(fā)生量不大，主要雜草為異型莎草，覆蓋率約為20%，下層有少量的空心蓮子草[Alternantheraphiloxeroides(Mart.) Griseb.]和節(jié)節(jié)菜。

2.2 轉(zhuǎn)基因水稻生存競爭力

2.2.1 出苗率 由表1可知，在第Ⅰ期，相同水稻在不同密度下的出苗率無顯著差異，相同密度下不同水稻的出苗率也無顯著差異。

在第Ⅱ期，B2A68低密度種植出苗率顯著低于中密度，但與高密度處理下的出苗率無顯著差異；Bar68-1在不同密度處理下的出苗率均沒有顯著差異；而常規(guī)稻3種種植密度之間的出苗率存在很大差異，其中中密度的出苗率顯著高于高密度、低密度。在相同密度處理下，中密度時3種水稻的出苗率無顯著差異，高密度、低密度時常規(guī)稻的出苗率顯著低于2種轉(zhuǎn)基因水稻。

第Ⅲ期和第Ⅳ期的情況與第Ⅰ期相同，即相同水稻在不同密度下的出苗率無顯著差異，相同密度下不同水稻的出苗率也無顯著差異。種植密度和播種時間對同一水稻品種的出苗率影響不大。

從出苗率的整體情況考察，B2A68沒有表現(xiàn)出比Bar68-1更高的出苗率，2種轉(zhuǎn)基因水稻的出苗率相當，多在70%以上；與常規(guī)稻相比，供試的2種轉(zhuǎn)基因水稻在大多數(shù)情況下沒有表現(xiàn)出更高的出苗率，但在第Ⅱ期高密度、低密度時2種轉(zhuǎn)基因水稻的出苗率顯著高于常規(guī)水稻的出苗率。

2.2.2 株高 直播第Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期的株高見圖1。25～70 d的株高調(diào)查結(jié)果顯示，同一密度處理下B2A68和Bar68-1多高于常規(guī)稻，且2種轉(zhuǎn)基因水稻之間的株高差異不顯著。但是從4期的最終株高來看，3種水稻的株高差異不明顯。研究結(jié)果還表明，相同水稻在不同種植密度下的株高沒有顯著差異，說明種植密度對株高影響不大。從數(shù)值上相比，第Ⅳ期的3種水稻的最終株高均低于前3期的相同品種的水稻，而前3期水稻的最終株高沒有顯著差異。

在移栽條件下，移栽后25～40 d，B2A68和Bar68-1的株高顯著高于常規(guī)稻，但2種轉(zhuǎn)基因水稻間的株高差異不顯著；55 d至最終，常規(guī)稻株高顯著高于2種轉(zhuǎn)基因水稻(圖2)，說明在草壓較小的情況下，2種轉(zhuǎn)基因水稻的長勢比常規(guī)稻弱。

表1 直播方式種植的3種水稻播種后10 d的出苗率(平均數(shù)±標準誤)

2.2.3 分蘗 由圖3可見，第Ⅰ、Ⅱ期，在播后 25～55 d，由于雜草競爭條件的存在，3種水稻的分蘗數(shù)都呈現(xiàn)出先增后減的趨勢。相同水稻在不同密度處理下分蘗數(shù)差異不大，相同密度處理下不同水稻的分蘗數(shù)差異也不大。第Ⅲ、第Ⅳ期由于處在水稻生長發(fā)育的非適宜期，各種水稻的分蘗數(shù)都很少。第Ⅳ期不同處理下的3種水稻分蘗數(shù)均為0。

在移栽條件下，3種水稻的分蘗數(shù)沒有顯著差別(圖3)。移栽后70 d調(diào)查的結(jié)果顯示，3種水稻的分蘗數(shù)量均在9～11個之間。

從分蘗數(shù)量上分析，在直播適宜期和非適宜期，在相同密度處理以及移栽條件下，3種水稻的分蘗數(shù)沒有顯著差異。

2.3 繁殖力調(diào)查

2.3.1 花粉活力 通過觀察和統(tǒng)計，3種水稻花粉活力在97%～99%之間，無顯著差異，花粉活力相當。

2.3.2 生育期比較 通過觀察和統(tǒng)計，3種水稻在4個播期下都能夠完成生活史，B2A68和Bar68-1的花期基本一致，常規(guī)稻的花期比2種抗性水稻晚：第Ⅰ、Ⅱ期晚10～14 d，第Ⅲ、Ⅳ期晚6～10 d(表2)。

2.3.3 生殖指標分析 由表3可知，從整體來看，相同水稻在不同密度下的生殖指標沒有太大差異。而在相同密度處理下，直播適宜期和非適宜期的2種轉(zhuǎn)基因水稻所考量的穗長和每穗飽粒數(shù)多顯著高于常規(guī)稻，2種轉(zhuǎn)基因水稻之間差異不顯著；2種轉(zhuǎn)基因水稻與常規(guī)水稻相比，結(jié)實率和地上部生物量無顯著差異。從數(shù)值上看，適宜期的各項指標(除結(jié)實率)整體上比非適宜的要高，說明B2A68和Bar68-1在不良氣候條件下生長競爭能力變?nèi)?。與當?shù)爻Ｒ?guī)稻相比，在直播條件下，無論是適宜期還是非適宜期，2種轉(zhuǎn)基因水稻的生殖指標(除結(jié)實率)都要高于常規(guī)水稻。就生殖生長指標分析，2種轉(zhuǎn)基因水稻沒有顯著差異，說明轉(zhuǎn)基因水稻沒有因為導(dǎo)入了2種外源基因而生長競爭力就變強。

表2 B2A68、Bar68-1、常規(guī)稻在4種播期下的花期(2012)

由表4可知，常規(guī)水稻的穗長顯著小于2種轉(zhuǎn)基因水稻，但每穗飽粒數(shù)顯著大于2種轉(zhuǎn)基因水稻，2種轉(zhuǎn)基因水稻之間無顯著差異；常規(guī)水稻和轉(zhuǎn)基因水稻的結(jié)實率和地上部生物量無顯著差異。這說明在生殖能力方面2種轉(zhuǎn)基因水稻弱于常規(guī)水稻。

表3 供試水稻在直播條件下的生殖指標

表4 供試水稻在移栽條件下生殖指標

2.3.4 落粒性 B2A68的落粒率為13.33%，Bar68-1的落粒率為12.80%，常規(guī)稻的落粒率為7.02%。在外力條件下，2種轉(zhuǎn)基因水稻的落粒率顯著高于常規(guī)稻。但參照應(yīng)存山的報道[9]，3種水稻的落粒性都處于中等水平。

2.3.5 自生苗情況 在收回需要考種的水稻之后對田間的自生苗進行調(diào)查，調(diào)查發(fā)現(xiàn)各小區(qū)中均無自生苗出現(xiàn)。

2.3.6 種子生存能力

2.3.6.1 種子萌發(fā)率 水稻種子收獲后30 d，從其萌發(fā)情況(圖4、圖5)來看，不論在直播還是移栽條件下，2種轉(zhuǎn)基因水稻的萌發(fā)情況一致，7 d時的萌發(fā)率均在80%以上。不同處理下的常規(guī)稻3 d時萌發(fā)率有所差異，但是7 d時萌發(fā)率接近100%。2種轉(zhuǎn)基因水稻的萌發(fā)相對不齊，全部萌發(fā)所需時間更長，到11 d時仍有少數(shù)種子不能萌發(fā)。常規(guī)稻沒有休眠的種子，而2種轉(zhuǎn)基因水稻未能萌發(fā)的種子用TTC檢測后發(fā)現(xiàn)只有不到0.01%的種子保持活力，處于休眠狀態(tài)。

2.3.6.1 種子活力保存能力 埋藏前，3種水稻種子活力均在90%以上，但是經(jīng)過埋藏后，不論是淺埋還是深埋，3種水稻種子活力都有一定程度的下降。其中經(jīng)過2個月淺埋后的B2A68和Bar68-1的種子活力迅速降低到20%左右，深埋處理下2種轉(zhuǎn)基因水稻種子活力迅速降低到13%左右；而常規(guī)稻在淺埋和深埋處理下2個月種子活力沒有迅速降低，均保持在80%以上。4～6個月，3種水稻種子活力下降得相對緩慢。2～6個月的淺埋和深埋處理下，2種轉(zhuǎn)基因水稻的種子活力無顯著差異，但顯著低于常規(guī)稻，說明2種轉(zhuǎn)基因水稻種子在土壤中保持活力的能力弱于常規(guī)稻(圖6、圖7)。

3 結(jié)論與討論

雜草是能夠在人工生境中自然繁衍其種族的植物，最大特點是適應(yīng)性、持續(xù)性、危害性[10]。當一個或多個外源基因?qū)胨竞笥锌赡芴岣咚镜纳娓偁幠芰?，而競爭力是判斷植物是否具有雜草性的主要因子之一。植物的競爭力強弱受到一系列影響因子的影響，如種子萌發(fā)特性、株高、生物量等[11]。本試驗中供試的復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因水稻B2A68在出苗率上與單一性狀轉(zhuǎn)基因水稻Bar-68是一致的，并沒有表現(xiàn)出更高的出苗率。而在有相似雜草競爭的環(huán)境下，B2A68與Bar-68在株高、分蘗、花粉活力、穗長、主穗飽粒數(shù)、結(jié)實率、落粒性、土壤中種子活力保存能力等方面都沒有顯著差異，說明B2A68并沒有因為導(dǎo)入2種外源基因而與單抗水稻Bar-68產(chǎn)生顯著不同，沒有表現(xiàn)出更強的競爭能力，演化為雜草的可能性也沒有因此變大。2種轉(zhuǎn)基因水稻與當?shù)胤N植的常規(guī)稻寧粳46相比，在相似的草壓下都沒有更強的侵略性。本試驗結(jié)果表明，以早秈稻D68為受體的轉(zhuǎn)入抗蟲抗除草劑的復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因抗水稻B2A68與單一性狀轉(zhuǎn)基因水稻Bar-68在整個生活史中競爭能力相似，沒有明顯的雜草化傾向，而且與當?shù)爻Ｒ?guī)稻相比，復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因水稻B2A68生存競爭優(yōu)勢也不突出，該水稻在南京地區(qū)演化為雜草的可能性不大。

休眠性和落粒性是評價作物雜草化潛力較為重要的2個特點，休眠性可以讓雜草避開非適宜期，這一特征與植物成為入侵能力強的雜草密切相關(guān)[12]。由于外源基因插入到水稻基因組的位置是隨機的，所以造成的影響是復(fù)雜和未知的。水稻休眠是由多個數(shù)量性狀位點(QTL)所控制，這樣的位點在水稻染色體上都有分布，在第12條上分布得最為廣泛[13-16]。外源基因的插入有可能造成水稻休眠性增強或降低，但是目前尚沒有這類報道，本試驗中的轉(zhuǎn)基因水稻沒有因為插入外源基因而使水稻休眠性發(fā)生明顯的變化。落粒性是雜草的一種繁衍種族的機制，也是作物與雜草最大的區(qū)別之一。在水稻中迄今已定位5個落粒基因(sh-1、sh-2、sh-3、sh-4 和sh-h)，與落粒相關(guān)的主效QTL也研究得很多[17]。在評價轉(zhuǎn)基因作物的雜草化中，落粒性是一項重要的指標，本研究中2種外源基因與1種外源基因?qū)胨竞髮λ韭淞Ｐ缘挠绊懖]有顯著差異，說明本試驗水稻外源抗蟲抗除草劑基因并沒有觸發(fā)水稻的落粒性。

目前復(fù)合性狀應(yīng)用較多的植物是玉米和棉花，但是水稻是世界上主要的糧食作物之一，針對復(fù)合性狀的轉(zhuǎn)基因水稻的雜草化環(huán)境風險制定一份標準是十分必要的。雖然復(fù)合性狀業(yè)已成為發(fā)展最快的基因技術(shù)之一，但是種植了復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因作物的國家和地區(qū)對其監(jiān)管的要求、內(nèi)容卻各不一樣。如美國、加拿大、巴西依據(jù)單個轉(zhuǎn)化事件管理復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因作物。歐盟對復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因作物的管理較為嚴格，評價時主要考慮插入基因的完整性和表型的穩(wěn)定性及復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因之間可能的相互作用，從選擇合適的參照物、成分的比較分析、毒性、過敏性和營養(yǎng)價值評價以及環(huán)境評價等方面評價其相互作用帶來的影響[1，18-20]。但我國尚未出臺復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因作物雜草化環(huán)境風險的評價標準。在轉(zhuǎn)基因技術(shù)快速發(fā)展的今天，需要加強對復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因作物的研究和管理。本試驗的開展可以為復(fù)合性狀轉(zhuǎn)基因水稻安全性評估標準的制訂提供一定的試驗依據(jù)。本試驗比較的是復(fù)合性狀和單一性狀轉(zhuǎn)基因水稻的雜草化風險，但是為了完整地制定管理標準，還需在試驗中設(shè)置非轉(zhuǎn)基因受體水稻空白對照進行研究。

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