成纖維樣滑膜細(xì)胞Toll樣受體在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的研究進(jìn)展

唐媚,胡松,唐信威,劉陽,王衍堂,鄒強(qiáng)*(.遵義醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,遵義 563003；.成都醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,成都 60083)

·綜 述·

成纖維樣滑膜細(xì)胞Toll樣受體在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的研究進(jìn)展

唐媚1,胡松2,唐信威2,劉陽2,王衍堂2,鄒強(qiáng)2*
(1.遵義醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,遵義 563003；2.成都醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室,成都 610083)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎；Toll樣受體；成纖維樣滑膜細(xì)胞

Toll樣受體(toll-like receptor, TLRs)是一種I型跨膜蛋白受體,可識別微生物上特定結(jié)構(gòu)的病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs)和宿主自身損傷細(xì)胞產(chǎn)生的損傷相關(guān)分子模式(damage-associated molecular patterns, DAMPs),在天然免疫中發(fā)揮著重要作用。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是以關(guān)節(jié)滑膜炎為主要特征的自身免疫性疾病。成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes, FLSs)異常增生及分泌炎性細(xì)胞因子,最終可致關(guān)節(jié)慢性炎癥和畸形[1]。FLSs是滑膜組織的重要組成成分之一,巨噬樣滑膜細(xì)胞活化后分泌的細(xì)胞因子如IL-1β可誘導(dǎo)FLSs增殖,隨后增生活化的FLSs一方面分泌趨化因子、炎性細(xì)胞因子引起關(guān)節(jié)炎癥,另一方面FLSs分泌基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)侵蝕軟骨,引起關(guān)節(jié)畸形,從而在RA的病理機(jī)制中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[2]。FLSs上表達(dá)的TLRs活化后,會(huì)激活下游一系列的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,啟動(dòng)炎性細(xì)胞因子、趨化因子以及MMPs的表達(dá),在RA發(fā)病進(jìn)程中扮演了重要角色。為此,對TLRs在免疫反應(yīng)中的調(diào)節(jié)作用及其胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)激活機(jī)制的研究將為RA治療提供新思路[3]。

1 TLRs結(jié)構(gòu)、信號通路及配體

TLRs的發(fā)現(xiàn)是近十余年天然免疫系統(tǒng)研究中最主要的進(jìn)展之一。它主要由3個(gè)功能區(qū)構(gòu)成:胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。其胞外區(qū)有19～25個(gè)富含亮氨酸的重復(fù)序列,此結(jié)構(gòu)能促進(jìn)蛋白質(zhì)間的相互黏附,有利于識別病原體及其產(chǎn)物,不同的TLRs胞外區(qū)同源性較低,可能與其識別不同結(jié)構(gòu)的配體相關(guān)[2]。TLRs的跨膜區(qū)富含半胱氨酸。TLRs的胞內(nèi)區(qū)與白細(xì)胞介素1受體(interleukin-1 receptor, IL-1R)的胞內(nèi)區(qū)結(jié)構(gòu)相似,為TIR(Toll IL-1R)同源區(qū),它是Toll蛋白和IL-1R向下游轉(zhuǎn)導(dǎo)信號的核心元件。不同的TLRs通過特異性識別一類PAMPs,如病毒、細(xì)菌和真菌；或來源于宿主自身損傷細(xì)胞產(chǎn)生DAMPs[4],如熱休克蛋白,介導(dǎo)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo),從而釋放促炎因子、趨化因子,誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生適應(yīng)性免疫反應(yīng)。

TLRs家族信號通路包括髓樣分化蛋白88(myeloid differentiation primary response protein 88, MyD88)依賴性傳導(dǎo)途徑和MyD88非依賴性傳導(dǎo)途徑兩種(見圖1)。在MyD88依賴性傳導(dǎo)途徑中,TLRs胞內(nèi)區(qū)域與MyD88羧基端的TIR結(jié)構(gòu)域相結(jié)合而激活MyD88。MyD88的DD結(jié)構(gòu)域與IL-1R相關(guān)激酶(IL-1R-associated kinases, IRAKs)的氨基端死亡區(qū)域相互作用,招募IRAKs到TLRs信號復(fù)合物上引起IRAKs自身磷酸化[5]。隨之,再與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumor necrosis factor receptor associates factor 6, TRAF6)結(jié)合[6],促使NF-κB抑制蛋白自身磷酸化,從而激活NF-κB使之從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核,最終輔助炎性細(xì)胞因子及刺激分子的轉(zhuǎn)錄、翻譯和表達(dá)。MyD88非依賴性傳導(dǎo)途徑是通過干擾素調(diào)節(jié)因子3(interferon regulatory factor 3, IRF3)和NF-κB的晚發(fā)活化實(shí)現(xiàn)。TLRs是通過β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TIR-domain-containing adaptor inducing interferon-β,TRIF)與TRIF連接,再與TRAF6結(jié)合：一方面激活I(lǐng)KKs復(fù)合體,使NF-κB抑制蛋白自身磷酸化,促使NF-κB從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核[7],并與DNA上NF-κB的位點(diǎn)結(jié)合,啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制；另一方面TRIF與TRF3結(jié)合,促使下游IRF3抑制蛋白自身磷酸化,隨后IRF3從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核內(nèi),啟動(dòng)干擾素的表達(dá)。

TLRs作為連接天然免疫和適應(yīng)性免疫的關(guān)鍵環(huán)節(jié),在免疫應(yīng)答中發(fā)揮著極為重要的作用。迄今已發(fā)現(xiàn)的人類TLRs有10種[8],在多種細(xì)胞中都有表達(dá),其中包括上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、免疫細(xì)胞(單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞)和非免疫細(xì)胞(樹突細(xì)胞)等。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)的人關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞TLRs有6種(見表1),其中TLR1在細(xì)胞膜上表達(dá),其配體是來源于細(xì)菌的三酰脂蛋白；TLR2在細(xì)胞膜上表達(dá),其主要配體有脂蛋白、肽聚糖、HSP60、HSP70、Gp96、LDL和HMGB1；TLR3在溶酶體的內(nèi)膜上表達(dá),其主要配體有雙鏈RNA；TLR4在細(xì)胞膜上表達(dá),其主要配體有脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)、HSP60、HSP70、HSPB8和Gp96；TLR5在細(xì)胞膜上表達(dá),其配體是來源于細(xì)菌的鞭毛蛋白；TLR6在細(xì)胞膜上表達(dá),其配體是二?；鞍譡8]。此外,FLSs上TLRs的表達(dá)和激活,對RA病理機(jī)制的研究有重要作用。

Ospelt等[9]在人滑膜細(xì)胞TLR(1-10)表達(dá)譜的研究中發(fā)現(xiàn)：TLR(1-6)的mRNA有表達(dá),TLR(7-10)的mRNA無表達(dá),其中TLR3的mRNA表達(dá)最高,TLR2、TLR4的mRNA表達(dá)稍弱,其他TLRs的mRNA的表達(dá)未能檢測出,提示TLR2、TLR3、TLR4對RA上FLSs的研究意義更為重大。為此,以下主要介紹FLSs上TLR2、TLR3、TLR4的配體種類、胞內(nèi)信號傳導(dǎo)途徑以及目前的研究結(jié)果。

表1 人關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞上TLRs定位、配體及來源

圖1 人FLSs上TLRs信號傳導(dǎo)途徑

2 TLR2激活與RA的關(guān)系

TLR2是目前已克隆出的TLRs家族中識別病原微生物種類最多且表達(dá)范圍最廣的成員。TLR2主要通過識別特異性PAMPs來促發(fā)機(jī)體對病原微生物的級聯(lián)免疫反應(yīng),其配體有革蘭氏陽性菌的菌細(xì)胞壁組分,如胞壁酸、肽聚糖和細(xì)菌脂肽,革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁的脂蛋白和脂肽聚糖,霉菌的細(xì)胞壁成分以及真菌的酵母聚糖等。其中,TLR2在識別細(xì)菌肽聚糖時(shí),需要TLR1和TLR6協(xié)助識別?；闹腫10]。新近研究[11]發(fā)現(xiàn),TLR2還可識別組織損傷的DAMPs和某些內(nèi)源性抗原,如熱休克蛋白和其他組織分泌的炎性因子。TLR2胞內(nèi)信號傳導(dǎo)是通過MyD88依賴性傳導(dǎo)途徑完成的。TLR2與TLR1或TLR6結(jié)合形成的異源二聚體可識別特異性配體；活化的TLR2胞內(nèi),TIR與MyD88羧基端結(jié)合后募集MyD88到受體上,隨后MyD88利用N端的DD結(jié)構(gòu)募集同樣含DD結(jié)構(gòu)的IRAK-1和IRAK-4；IRAK-1被IRAK-4作用后磷酸化,并從受體復(fù)合體上解離且與TRAF6結(jié)合使之活化,最終促使NF-κB轉(zhuǎn)遷到核內(nèi),激活相應(yīng)基因的轉(zhuǎn)錄[12]。

目前實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果[13]表明,FLSs上TLR2的激活與RA發(fā)病密切相關(guān),其中主要表現(xiàn)在RA的促炎反應(yīng)中。Schrijver等[14]在RA病人滑膜液中檢測到細(xì)菌的肽聚糖成分,提示TLR2可能參與RA的發(fā)病過程。Kyburz等[15]用TLR2配體刺激滑膜細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)TLR2配體可促進(jìn)滑膜細(xì)胞釋放結(jié)合素、MMP、IL-6和IL-8等促炎因子。在小鼠關(guān)節(jié)動(dòng)物模型[16]中,小鼠關(guān)節(jié)注射TLR2配體(細(xì)菌肽聚糖)可形成嚴(yán)重的關(guān)節(jié)炎,表明在只有肽聚糖而無活菌的情況下,也可刺激關(guān)節(jié)產(chǎn)生炎癥反應(yīng)。Pierer等[17]系統(tǒng)研究了RA病人滑膜細(xì)胞上TLR2介導(dǎo)的炎癥因子表達(dá)情況：通過TLR2配體(細(xì)菌肽聚糖)刺激滑膜細(xì)胞,建立體外模型篩選炎癥因子基因表達(dá)；利用高通量寡核苷酸微陣列對其技術(shù)分析發(fā)現(xiàn),有74個(gè)基因表達(dá)增高,其中新發(fā)現(xiàn)了14個(gè)編碼化學(xué)增活素的基因；定量PCR檢測肽聚糖刺激后的正常人FLSs mRNA發(fā)現(xiàn),粒細(xì)胞趨化蛋白2(granulocyte chemotactic protein2, GCP2)、T細(xì)胞激活分泌調(diào)節(jié)因子(RANTES)、單核細(xì)胞趨化蛋白2(monocyte chemoattractant protein2, MCP-2)、IL-8以及生長相關(guān)癌基因-2的表達(dá)均顯著升高,MCP-1、EXODUS、CXCL-16表達(dá)量也有所升高；同時(shí),經(jīng)刺激的細(xì)胞上清中也有GCP2、RANTES和MCP2的分泌,在RA病人的滑膜組織中也檢測到GCP2和MCP2,而在骨關(guān)節(jié)炎病人的滑膜組織中卻未檢測到。由此可見,TLR2配體通過刺激滑膜細(xì)胞活化釋放趨化因子,對RA的炎癥浸潤起了較大作用。

3 TLR3激活與RA的關(guān)系

TLR3是位于細(xì)胞內(nèi)的模式識別受體(pattern recognition receptor, PRR),可識別病毒雙鏈RNA(dsRNA)。而宿主細(xì)胞本身不產(chǎn)生dsRNA,因此病毒在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的dsRNA可被一種PAMPs識別。TLR3是唯一一種通過MyD88非依賴性傳導(dǎo)途徑進(jìn)行信號傳導(dǎo)的TLRs。Brentano等[18]用TLR3配體poly(I∶C)刺激關(guān)節(jié)滑膜細(xì)胞,可檢測到炎性細(xì)胞因子和趨化因子,如IL-6、IFN-β、CCL5。RA病人壞死的滑膜細(xì)胞刺激FLSs,也可在上清中檢測到上述細(xì)胞因子,提示壞死的滑膜細(xì)胞RNA可能是由TLR3的內(nèi)源性配體刺激FLSs促炎因子基因表達(dá)而形成。FLSs上TLR3受體的激活與RA炎癥的產(chǎn)生關(guān)系密切。Brentano等[18]用TLR3配體刺激RA和骨性關(guān)節(jié)炎(osseous arthritis, OA)病人的FLSs,發(fā)現(xiàn)RA滑膜細(xì)胞上TLR3的表達(dá)量高于OA。Roelofs等[19]發(fā)現(xiàn)RA病人滑膜組織上的TLR3受體比正常人表達(dá)量高。Ospelt等[9]研究顯示,早期RA病人滑膜細(xì)胞上TLR3表達(dá)量比持續(xù)期的表達(dá)量高。然而在FLSs上TLR3的炎性研究中出現(xiàn)了相互矛盾的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 Zare等[20]發(fā)現(xiàn)正常小鼠關(guān)節(jié)在注射了dsRNA后會(huì)出現(xiàn)關(guān)節(jié)炎癥,但同樣的現(xiàn)象也出現(xiàn)在TLR3基因敲除小鼠上,這似乎無法解釋TLR3參與RA促炎的機(jī)制。然而隨后,Magnusson等[21]研究顯示,dsRNA刺激關(guān)節(jié)后是通過單核/巨噬細(xì)胞分泌IFN-α來引起關(guān)節(jié)炎癥反應(yīng)的。Yarilina等[22]在血清和膠原抗體誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[22]中發(fā)現(xiàn),TLR3配體對關(guān)節(jié)炎癥有一定的抑制作用,表明FLSs上的TLR3介導(dǎo)了關(guān)節(jié)的抗炎反應(yīng)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明,TLR3參與了RA病程發(fā)生發(fā)展過程,其中包括促炎和抗炎兩個(gè)方面,但TLR3在RA中介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的機(jī)制仍不清晰。

4 TLR4激活與RA的關(guān)系

TLR4是IL-1R家族的一員,是人類發(fā)現(xiàn)的首個(gè)TLRs相關(guān)蛋白,幾乎表達(dá)在所有細(xì)胞系上[23]。TLR4的配體種類繁多,按不同來源可分為內(nèi)源性配體和外源性配體；其中內(nèi)源性配體主要是因機(jī)體損傷、壞死或凋亡細(xì)胞釋放的熱休克蛋白、氧自由基和神經(jīng)介質(zhì)等,而外源性配體主要是LPS。TLR4胞內(nèi)信號傳導(dǎo)包括MyD88依賴性傳導(dǎo)途徑和MyD88非依賴性傳導(dǎo)途徑兩種。

目前FLSs上TLR4在炎癥方面的研究結(jié)果相互對立,大部分集中在TLR4介導(dǎo)促炎反應(yīng)方面。Roelofs等[19]在RA病人的滑膜液、血清中檢測到了高含量的TLR4配體,其中TLR4的內(nèi)源性配體通過介導(dǎo)炎性細(xì)胞因子分泌來加重關(guān)節(jié)炎癥。同時(shí),Ospelt等[9]發(fā)現(xiàn),RA病人FLSs上TLR4的表達(dá)量升高,尤其在病程早期和持續(xù)期更為顯著。Nair等[24]通過RA和OA病人的滑膜液刺激體外培養(yǎng)的滑膜細(xì)胞,檢測到微量的IL-8；經(jīng)LPS和滑膜液共同刺激滑膜細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)IL-8分泌明顯升高。此外Nair等[24]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)滑膜液中存在的可溶性CD14分子可增強(qiáng)TLR2和TLR4的表達(dá)。Lee等[25]在CII抗體誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎的小鼠動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn),TLR4基因敲除小鼠的關(guān)節(jié)腫脹程度,促炎因子COX-2、TNF-α的分泌量均低于野生型小鼠。同樣,在用免疫復(fù)合物誘導(dǎo)的小鼠關(guān)節(jié)炎模型(immune comlex-mediated arthritis,ICA)中發(fā)現(xiàn),TLR4-/-小鼠關(guān)節(jié)腫脹程度輕于野生型小鼠,趨化因子以及IL-1、IL-6等促炎因子的分泌也明顯減少。然而,在含有沙眼衣原體滑膜細(xì)胞誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型[26]中,發(fā)現(xiàn)TLR4基因缺陷小鼠的關(guān)節(jié)炎癥狀較正常組小鼠嚴(yán)重。TLR4受體激活后會(huì)加重IL-1引起的關(guān)節(jié)炎癥[27],而TLR4-/-小鼠可減輕因IL-1Ra基因缺失引起的關(guān)節(jié)炎癥狀[28],表明TLR4參與了抗炎反應(yīng)。目前對TLR4配體存在、受體表達(dá)和發(fā)病機(jī)制的研究已較廣泛,但仍存在一些相互矛盾的實(shí)驗(yàn)結(jié)果,說明現(xiàn)階段還不能透徹地認(rèn)識TLR4參與RA發(fā)病的分子機(jī)制。由此猜想,TLR4介導(dǎo)促炎反應(yīng)和抗炎反應(yīng)是否與其存在兩條信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑相關(guān)：MyD-88依賴性轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與的促炎反應(yīng)起著主要作用,而MyD88非依賴性轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑參與的抗炎反應(yīng)起著次要作用。

5 滑膜細(xì)胞上TLRs在RA靶向治療的應(yīng)用

傳統(tǒng)的藥物和療法對RA病情的緩解有一定療效,但不能完全治愈。靶向關(guān)鍵細(xì)胞因子的生物制劑因價(jià)格昂貴、需反復(fù)注射和存在局部不良反應(yīng)等缺陷,也無法滿足RA的治療需要,這使得探究治療RA的有效方法成為研究的熱點(diǎn)。研究結(jié)果[29]證實(shí),TLRs在RA的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用,因此靶向TLRs受體也成為RA的治療方法：阻斷TLRs下游信號介導(dǎo)蛋白質(zhì)分子,采用中和抗體或可溶性假性抗體來阻斷TLRs配體和受體結(jié)合以抑制炎癥以及阻斷受體二聚化[30]等。

在抑制關(guān)節(jié)炎動(dòng)物模型[31]中,輔助T細(xì)胞2表達(dá)的內(nèi)毒素和肥大細(xì)胞表達(dá)的ST2蛋白可阻斷TLR4介導(dǎo)的信號傳導(dǎo)通路,從而減輕炎癥反應(yīng)。SIGIRR可通過負(fù)向調(diào)控TLR4的信號傳導(dǎo)通路,來抑制RA病人FLSs產(chǎn)生炎性因子和細(xì)胞因子[32]。NovImmune公司研發(fā)的單克隆抗體NI0101/α可抑制TLR4激活,從而阻斷下游信號傳導(dǎo)[33]。烷酮衍生物、蘿卜硫素和OSL07可抑制TLR4二聚化從而阻斷下游信號[34]。Opsona公司研發(fā)的抗TLR2抗體、OPN-301可阻止RA病人體外培養(yǎng)的FLSs分泌炎性細(xì)胞因子?；ぜ?xì)胞上TLRs信號傳導(dǎo)途徑與RA的發(fā)生發(fā)展有必然聯(lián)系,因此,闡明靶向滑膜細(xì)胞上TLRs信號傳導(dǎo)途徑將為RA的治療提供新的思路。

6 展望

目前,臨床上傳統(tǒng)的RA治療方法存在諸多不足,迫切需要尋找新的有效療法。研究[29]發(fā)現(xiàn),TLRs在RA的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用,主要表現(xiàn)在介導(dǎo)炎性介質(zhì)生成和促進(jìn)滑膜細(xì)胞增殖兩大方面。然而,目前對TLRs參與RA的分子機(jī)制及TLRs之間的相互影響仍無全面透徹的認(rèn)識,希望在不久的將來能從多角度透徹研究TLRs和RA之間的關(guān)系,以便為RA的臨床治療提供新思路。

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國家自然基金資助項(xiàng)目(NO:81273530,81202363,81302786)

鄒強(qiáng),E-mail：qiangzou99@gmail.com

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20140410.1537.005.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2014.02.032

R392.9

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