抗-HCV ELISA試劑評估結(jié)果分析

范文成,涂林,張寧寧,朱容,譚寒玉,陳素瓊(綿陽市紅十字中心血站,綿陽 621000)

·論 著·

抗-HCV ELISA試劑評估結(jié)果分析

范文成,涂林*,張寧寧,朱容,譚寒玉,陳素瓊
(綿陽市紅十字中心血站,綿陽 621000)

目的 用酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)的雙抗原夾心法和間接法檢測抗-HCV,并對不同檢測方法的試劑進行評估。方法 用1種雙抗原夾心法和4種間接法檢測抗-HCV血清盤和不同濃度的室內(nèi)質(zhì)控品,嚴格按試劑說明書在Xantus全自動加樣儀和FAME全自動酶免分析儀中進行檢測。結(jié)果 經(jīng)用不同的ELISA法檢測抗-HCV后,血清盤中陰性參考品符合率均為20/20,陽性參考品符合率均為20/20。雙抗原夾心法靈敏度高,0.05 NCU/mL的室內(nèi)質(zhì)控品能完全檢測出來,間接法最低檢出為0.5 NCU/mL,間接法的10個單試劑陽性標本用雙抗原夾心法和RIBA確認法檢測全部為陰性。結(jié)論 雙抗原夾心法的抗-HCV ELISA試劑靈敏度和特異性均優(yōu)于間接法。

抗-HCV;ELISA;試劑評估

丙型肝炎是一種主要經(jīng)過血液和性傳播的傳染病。1989年美國學者Choo等[1]首次從受感染的黑猩猩血液標本中分離出丙型肝炎病毒(HCV)。據(jù)報道[2],全球現(xiàn)有1.3億～1.7億人口感染了HCV。我國丙型肝炎感染高發(fā)時間在20世紀80年代末至90年代初。流行病學調(diào)查[3]顯示,我國人群HCV抗體陽性率約3.2%。目前仍無有效疫苗預防丙型肝炎的感染,而主要通過增加檢測試劑的敏感性和特異性,來減少丙型肝炎的血液傳播。酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)法特異性強,靈敏度高,數(shù)據(jù)能自動儲存,且便于標準化、自動化和網(wǎng)絡化[4],因而廣泛應用于血液篩查和臨床檢測。但ELISA法檢測抗-HCV仍采用間接法進行,而間接法檢測假陽性率高,尤其是在丙型肝炎低流行人群中,假陽性率達到30%,給個人和社會造成了不必要的疾病負擔[5]。為此,建立一種不降低檢測敏感性但可增加特異性的方法就顯得尤為必要。本文旨在用ELISA雙抗原夾心法和間接法檢測抗-HCV,評估和比較其靈敏度和特異性,現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 試劑

抗-HCV雙抗原夾心法試劑1家,用A1表示；抗-HCV間接法試劑4家,分別用A2(進口試劑)、A3、A4、A5表示；RIBA確認法用A6表示。試劑均經(jīng)中國藥品生物制品檢定所批檢合格,并在有效期內(nèi)使用。

1.2 標本

北京康徹思坦生物技術有限公司參考血清盤40支,批號201304004；北京康徹思坦生物技術有限公司室內(nèi)質(zhì)控品(含量4 NCU/mL、2 NCU/mL、1 NCU/mL、0.5 NCU/mL和0.05 NCU/mL)各10支；留取2013年1～12月抗-HCV單試劑陽性標本10份。

1.3 儀器設備

Xantus全自動加樣儀,FAME2420全自動酶免分析系統(tǒng),Liswell實驗室軟件。

1.4 方法

在Xantus全自動加樣儀、FAME全自動酶免分析儀上按照抗-HCV雙抗原夾心法檢測規(guī)程和試劑說明書進行編程。在Xantus標本架上放置檢測樣品,分別放血清盤標本和康徹思坦不同濃度的室內(nèi)質(zhì)控品。經(jīng)Xantus全自動加樣處理后,移至FAME全自動酶免分析儀進行自動孵育、洗板、加試劑等處理。最后,Liswell實驗室軟件讀取檢測結(jié)果?？?HCV單試劑陽性標本用不同試劑進行檢測,用RIBA法確認。

2 結(jié)果

2.1 5種抗-HCV ELISA試劑血清盤檢測情況

使用血清盤檢測5種抗-HCV ELISA試劑,血清盤中有20個陰性,20個陽性,并且在NS4、NS5、NS3、C區(qū)有不同強度的陽性標本。結(jié)果顯示：血清盤陰性、陽性符合率均為20/20；弱陽性標本檢測,間接法的幾種試劑OD值均為1.0以下,但雙抗原夾心法的抗-HCV試劑OD值全部在2.5以上(見表1)。

2.2 室內(nèi)質(zhì)控品檢測結(jié)果

用不同含量的室內(nèi)質(zhì)控品重復測定,根據(jù)S/CO均值選擇弱陽性的室內(nèi)質(zhì)控。雙抗原夾心法的抗-HCV試劑用0.05 NCU/mL含量質(zhì)控品,S/CO均值在2～4之間；其他國產(chǎn)試劑間接法需用0.5 NCU/mL含量的質(zhì)控品,S/CO均值在2～4之間；進口試劑需選用2 NCU/mL含量的質(zhì)控品(見表2)。

表1 5種抗-HCV ELISA試劑血清盤檢測情況

2.3 10份抗-HCV單試劑陽性標本檢測結(jié)果

用抗-HCV單試劑陽性標本10份,間接法試劑檢測A2試劑有3個陽性,A3試劑有4個陽性,A4試劑有2個陽性,A5試劑有1個陽性；用雙抗原夾心法與RIBA確認法檢測全部為陰性(見表3)。

表2 室內(nèi)質(zhì)控品檢測結(jié)果

表中的“”為：未檢測

表3 10份抗-HCV單試劑陽性標本檢測結(jié)果

3 討論

表1血清盤的檢測數(shù)據(jù)顯示：本次評估確認的5種試劑中,參考血清盤的陰性符合率為100%,陽性符合率也為100%；參考血清盤中確認結(jié)果陽性中NS4、NS5、NS3顯示為“±”；間接法的幾種試劑OD值均為1.0以下,但雙抗原夾心法的抗-HCV試劑OD值全部在2.5以上；參考血清盤中的弱陽性全部檢測出來,且都為強陽性。因此,血站在選擇酶免診斷試劑時,首先應以參考品試驗為依據(jù),注重試劑的靈敏度和特異性,以防止弱陽性標本漏檢和陰性標本誤判為陽性[6]。

表2室內(nèi)質(zhì)控品的檢測結(jié)果顯示：雙抗原夾心法的抗-HCV試劑靈敏度較高,用0.05 NCU/mL含量質(zhì)控品,S/CO均值在2～4之間,相當于其他國產(chǎn)試劑間接法0.5 NCU/mL含量的質(zhì)控品,提示在選擇試劑的室內(nèi)質(zhì)控品濃度時,不能只有1種室內(nèi)質(zhì)控品供所有試劑使用[7]。使用雙抗原夾心法的抗-HCV試劑僅能選用0.05 NCU/mL含量質(zhì)控品,如果選用1 NCU/mL、0.5 NCU/mL含量質(zhì)控品,就起不到用弱陽性做室內(nèi)質(zhì)控的作用。進口試劑由于包被片段的原因,可選用2 NCU/mL含量質(zhì)控品,其他國產(chǎn)間接法試劑可選用0.5 NCU/mL含量質(zhì)控品。這對下一步開展常規(guī)檢測時如何選擇室內(nèi)質(zhì)控品具有重要指導意義。

表3顯示：雙抗原夾心法的特異性較高,用雙抗原夾心法檢測全部為陰性,RIBA法確認也全部為陰性,與王國華等[8]報道符合。由于雙抗原夾心法檢測存在兩次與HCV抗體的特異性反應,可降低因酶標二抗引起的假陽性,從而提高特異性。

使用高質(zhì)量的試劑,能有效保證血液的質(zhì)量和臨床用血安全。2010年10月國家食品藥品監(jiān)督管理局(SFDA)將用于血篩的ELISA試劑全部從一步法改為兩步法,孵育時間延長,從而提高了試劑的靈敏度[9]。目前,雙抗原夾心法的抗-HCV試劑上市使用,是ELISA檢測抗-HCV又一大質(zhì)的飛躍。其主要優(yōu)勢體現(xiàn)在以下方面：1)在間接法檢測IgG的基礎上,增加了IgM檢測,因IgM是早于IgG出現(xiàn)的抗體,這樣窗口期提前了7～30 d(不同病例有差異)；另外,由于增加了IgM檢測,也同時提高了靈敏度。2)基因工程重組表達的抗原作為原料取代了酶標二抗,原料純度大幅度提高,從而提高了特異性；同時,雙抗原夾心法的雙特異性系統(tǒng)相比間接法的單特異性系統(tǒng)在特異性方面也有較大提升。3)使用生物素-親和素級聯(lián)放大系統(tǒng),能大幅度提升試劑的靈敏度(顯色信號放大程度是酶標二抗的4倍)。4)加樣量由間接法的10 μL提高到50 μL,避免了掛針等造成的誤差,結(jié)果重復性好、便于畫質(zhì)控圖,同時也提升了靈敏度。5)最低檢出線：間接法最低檢出線為0.5 NCU/mL,而雙抗原夾心法為0.05 NCU/mL。

綜上所述,ELISA試劑的選擇是保證血液檢測質(zhì)量的關鍵因素[10],建議有條件的醫(yī)院或采供血系統(tǒng)使用雙抗原夾心法的抗-HCV試劑。

[1] Choo QL, Kuo G, Weiner AJ,etal. Isolation of a cDNA clone derived from a blood-borne non-A, non-B viral hepatitis genome[J]. Science, 1989, 244(4902): 359-362.

[2] Baldo V, Baldovin T, Trivello R,etal. Epidemiology of HCV infection[J]. Current Pharmaceutical Design, 2008, 14(17): 1646-1654.

[3] 中華醫(yī)學會肝病學分會、傳染病與寄生蟲學分會.丙型肝炎防治指南[J].中華肝病雜志,2004,12(2)：194-198.

[4] 趙秀英,陳俊梅,辛永梅,等. 不同方法檢測乙型肝炎病毒血清標志物的差異[J]. 肝臟,2008,13(4)：303-305.

[5] 王曉艷. 雙抗原夾心法 ELISA 檢測丙型肝炎病毒抗體[D]. 北京：中國疾病預防控制中心, 2011.

[6] 葛紅衛(wèi),王鴻捷,常纓,等.血液檢測實驗室ELISA試劑的選擇評價[J].中國輸血雜志,2004,17(6):422-423.

[7] 袁學敏,舒群峰,崔萍,等.5種國產(chǎn)抗-HCV ELISA試劑血清盤考核結(jié)果分析[J].臨床輸血與檢驗,2012,14(2):179-181.

[8] 王國華,張賀秋,李少波,等.雙抗原夾心法與間接ELISA法檢測抗HCV對比研究[J].中國醫(yī)學檢驗雜志,2005,6(4)：318-319.

[9] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：三部[M].北京：中國醫(yī)藥科技出版社,2010: 333-334.

[10] 胡維,陳紅,劉春蘭.乙肝表面抗原ELISA試劑2次評估結(jié)果分析[J]. 中國輸血雜志,2013,26(12): 1268-1269.

Result Analysis and Evaluation of Anti-HCV ELISA Reagents

FANWen-cheng,TULin*,ZHANGNing-ning,ZHURong,TANHan-yu,CHENSu-qiong

(MianyangRedCrossBloodCenter,Mianyang621000,China)

Objective To detect anti-HCV by using the double antigen sandwich method and the indirect method, and to evaluate the reagents in different assay methods. Methods Use 1 double antigen sandwich method and 4 indirect methods to detect anti-HCV blood serum-plate and internal quality controls with different concentrations. The detection is conducted in Xantus Automatic sampling instrument and FAME Fully Automated Enzyme Immunoassay Analyzer according to the reagent instruction strictly. Results After using different ELISA methods to detect anti-HCV, the coincidence rate to negative reference panel (-/-) in all blood serum plates was 20/20 and the coincidence rate to positive reference panel (+/+) was 20/20. The double antigen sandwich method had a high sensitivity, and it can detect 0.05 NCU/mL of internal quality control completely. The indirect method can detect 0.5 NCU/mL at minimum. All 10 single reagent specimens that showed positive result in the indirect method were confirmed to be negative in the double antigen sandwich method and the confirmatory test RIBA. Conclusion The anti-HCV ELISA reagent in double antigen sandwich method has a higher sensitivity and specificity than those of the indirect methods.

Anti-HCV; ELISA; Reagent Evaluation

中國高校醫(yī)學期刊臨床專項資金(NO:11321501)

涂林,E-mail:2630618109@qq.com

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20140415.1050.006.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2014.02.012

R446.61

A