HPLC法測(cè)定大鼠肝微粒體中UGT酶的底物

洪麗霞,呂紅霞,石明芯,王佳慧,代晶(成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,成都 610083)

·論 著·

HPLC法測(cè)定大鼠肝微粒體中UGT酶的底物

洪麗霞,呂紅霞,石明芯,王佳慧,代晶*
(成都醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,成都 610083)

目的 建立測(cè)定大鼠肝微粒中UGT酶底物的HPLC方法。方法 選擇對(duì)硝基酚、對(duì)乙酰氨基酚作為UGT的特異性底物。采用高效液相色譜法,分別以非那西丁、咖啡因作為內(nèi)標(biāo),色譜柱為 Welchrom C18,體積流量為1 mL/min,柱溫為30 ℃。對(duì)硝基酚和對(duì)乙酰氨基酚的流動(dòng)相分別為乙腈-0.01 mol/L的醋酸銨緩沖液(pH 5.00)=35∶65和乙腈-水=14∶86, 對(duì)應(yīng)的檢測(cè)波長(zhǎng)分別為316 nm和244 nm。 結(jié)果 對(duì)硝基酚和對(duì)乙酰氨基酚在0.5～100 μmol/L范圍內(nèi),線性關(guān)系良好。對(duì)硝基酚的日內(nèi)精密度和日間精密度RSD%﹤14.7%,方法回收率為89.9%～111.0%,提取回收率>86.5%。對(duì)乙酰氨基酚的日內(nèi)精密度和日間精密度RSD%﹤13.0%,方法回收率105.6% ～114.2%,提取回收率>78.3%。結(jié)論 兩組方法靈敏、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確,可用于大鼠肝微粒體中UGT酶活性的測(cè)定。

高效液相色譜法；尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶；對(duì)硝基酚；對(duì)乙酰氨基酚；肝微粒體

尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶(UGT) 是生物體內(nèi)重要的Ⅱ相代謝酶,其主要作用是催化內(nèi)源及外源化合物進(jìn)行葡萄糖醛酸結(jié)合反應(yīng),增加其極性,便于隨尿及膽汁排出體外。 UGT廣泛分布于腎臟、腦、皮膚、腸、脾、胸腺、心臟等組織,其中以肝臟中該酶的活性最高[1]。在藥物的Ⅱ相代謝反應(yīng)中,這種反應(yīng)占到35%[2],因此研究藥物與UGT 酶的關(guān)系,對(duì)藥物相互作用、解毒排毒機(jī)制的研究具有十分重要的意義。本文選擇對(duì)硝基酚、對(duì)乙酰氨基酚為UGT底物[3,4], 建立測(cè)定大鼠肝微粒體中UGT酶底物的HPLC法。該方法簡(jiǎn)單、靈敏度高、準(zhǔn)確度好,可為UGT酶活性的測(cè)定提供參考方法。

1 材料與方法

1.1 材料

非那西丁和對(duì)乙酰氨基酚(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)分別為100095-198904、100018-200408),對(duì)硝基酚(成都科龍化工試劑廠,批號(hào)：070608),色譜純乙腈(美國(guó)Dikma公司),其余試劑均為分析純。高效液相色譜儀(美國(guó)戴安公司),包括P680泵、ASI-100自動(dòng)進(jìn)樣器、UV1700型檢測(cè)器、TC100柱溫箱和Chromeleon工作站。SD大鼠10只(雄性,體質(zhì)量250±20 g)購(gòu)自四川大學(xué)華西實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,合格證號(hào):SYXK(川)2008-113。

1.2 溶液的配制

取非那西丁和咖啡因?qū)φ掌愤m量,精密稱定,用甲醇溶解稀釋配制成0.5 mmol/L的對(duì)照品溶液。分別取對(duì)硝基酚、對(duì)乙酰氨基酚適量,精密稱定,用甲醇稀釋配制成10 mmol/L的貯備液,再用甲醇稀釋濃度為1 000、500、200、100、50、20、10、5 μmol/L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。上述溶液置于4 ℃冰箱中保存,備用。

1.3 肝微粒體的制備與測(cè)定

[5]制備大鼠肝微粒,并測(cè)定蛋白濃度。

1.4 樣品前處理方法

分別取對(duì)硝基酚和對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品溶液50 μL,揮干溶劑,加入肝微粒體和0.1 mol/L Tris-HCl(pH7.4)緩沖液,使溶液的終體積為0.5 mL,蛋白的終濃度為0.5 g/L。再加入乙酸乙酯2.0 mL,內(nèi)標(biāo)溶液50 μL,渦旋萃取3.0 min,取有機(jī)層揮干溶劑,殘?jiān)?.1 mL流動(dòng)相溶解,取20 μL進(jìn)樣分析。

1.5 色譜條件

色譜柱為Welchrom C18柱(250×4.6 mm,5 μm),柱溫為30 ℃,體積流量為1.0 mL/min。對(duì)硝基酚的流動(dòng)相為乙腈-0.01mol/L的醋酸銨緩沖液(pH5.0)(35∶65),檢測(cè)波長(zhǎng)為316 nm；對(duì)乙酰氨基酚的流動(dòng)相為乙腈-水(14∶86),檢測(cè)波長(zhǎng)為244 nm。兩組柱溫均為30 °C,流速為1.0 mL/min。

1.6 分析方法的驗(yàn)證

試驗(yàn)對(duì)兩組HPLC法進(jìn)行了系統(tǒng)適用性、線性、定量下限、精密度、回收率和穩(wěn)定性的驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

分別取空白肝微粒體、空白肝微粒體加對(duì)硝基酚和非那西丁,空白肝微粒體加對(duì)乙酰氨基酚和咖啡因,參照“1.4”和“1.5”項(xiàng)方法處理和分析樣品。在此條件下,非那西丁和對(duì)硝基酚的保留時(shí)間分別為7.8 min和10.4 min,理論塔板數(shù)均大于13 000；對(duì)乙酰氨基酚和咖啡因的保留時(shí)間分別為5.8 min和8.5 min,理論塔板數(shù)均大于11 000。兩組方法中各成分達(dá)基線分離,內(nèi)源性物質(zhì)無(wú)干擾(見圖1)。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

分別取對(duì)硝基酚和對(duì)乙酰氨基酚系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各50 μL,揮干溶劑后,加入肝微粒溶液,每個(gè)濃度樣品一式3份,參照“1.4”和“1.5”項(xiàng)方法處理和分析樣品。以各底物峰面積與內(nèi)標(biāo)峰面積之比作為縱坐標(biāo)(Y),以各底物濃度作為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行線性回歸。同時(shí)以信噪比≥10計(jì)算定量下限(LLOQ)。結(jié)果顯示:對(duì)硝基酚和對(duì)乙酰氨基酚在0.5～100 μmol/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好,回歸方程分別是Y=0.0107X+0.0055和Y=0.0216X+0.0042；相關(guān)系數(shù)依次是0.9999和0.9993；LLOQ均為0.5 μmol/L。

2.3 精密度和回收率試驗(yàn)

制備高、中、低3個(gè)濃度的對(duì)硝基酚、對(duì)乙酰氨基酚質(zhì)控樣品,每一濃度平行制備5份,參照“1.4”和“1.5”項(xiàng)方法,1 d內(nèi)進(jìn)樣分析,記錄色譜,計(jì)算日內(nèi)精密度,連續(xù)測(cè)定3 d,計(jì)算日間精密度。將檢測(cè)得到的底物與內(nèi)標(biāo)峰面積之比代入回歸方程,計(jì)算方法回收率。再取同等濃度的各底物和內(nèi)標(biāo)對(duì)照品溶液,直接揮干溶劑,流動(dòng)相溶解后進(jìn)樣分析,記錄色譜,將肝微粒體內(nèi)的底物的標(biāo)峰面積與對(duì)照峰面積進(jìn)行比較,計(jì)算提取回收率(見表1)。

表1 精密度和回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別將低、中、高3個(gè)濃度的對(duì)硝基酚、對(duì)乙酰氨基酚質(zhì)控樣品置于室溫和-20 ℃冰箱中保存。置于室溫的樣品分別于24 h和48 h后進(jìn)行測(cè)定。置于-20 ℃冰箱中的樣品分別于3 d和7 d后測(cè)定。結(jié)果顯示:置于室溫的對(duì)硝基酚和對(duì)乙酰氨基酚的測(cè)定結(jié)果RSD%<3.2%和RSD<4.8%；置于冰箱的測(cè)定結(jié)果RSD%<7.6%和RSD%<9.3%。表明兩組質(zhì)控樣品在室溫48 h內(nèi)穩(wěn)定,在-20 ℃冰箱7 d內(nèi)穩(wěn)定。

圖1 HPLC圖A.對(duì)硝基酚組的空白肝微粒體;B. 空白肝微粒體加對(duì)硝基酚和非那西丁;C. 對(duì)乙酰氨基酚組的空白肝微粒體;D. 空白肝微粒體加對(duì)乙酰氨基酚和咖啡因1. 非那西丁(內(nèi)標(biāo))；2. 對(duì)硝基酚; 3. 對(duì)乙酰氨基酚； 4. 咖啡因(內(nèi)標(biāo))

3 討論

本試驗(yàn)對(duì)色譜條件進(jìn)行了篩選,比較了甲醇、乙腈和不同pH緩沖溶液的洗脫效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：乙腈的洗脫能力較強(qiáng),對(duì)硝基酚在pH5.0溶液、對(duì)乙酰氨基酚在水溶液中可以得到滿意的分離效果。試驗(yàn)還比較了乙腈直接沉淀蛋白、氯仿-乙酸乙酯(3∶2)萃取、乙醚萃取、乙酸乙酯萃取幾種前處理方法。結(jié)果顯示：氯仿-乙酸乙酯和乙醚的提取率很低(<50%),而乙腈和乙酸乙酯提取率較高。考慮到經(jīng)乙酸乙酯萃取,體系中的雜質(zhì)較少,去除蛋白效果好,故選擇乙酸乙酯作為提取試劑。

目前UGT酶活性的測(cè)定方法主要有放射檢測(cè)法、紫外法、熒光法和LC-MS法等。放射檢測(cè)法以14C-二磷酸尿苷葡萄糖醛酸作為酶底物, 以放射自顯影術(shù)測(cè)定酶活性,該方法底物較為昂貴,測(cè)定周期長(zhǎng),技術(shù)不易普及[6]；紫外法主要以2-氨基酚為底物,利用重氮化偶合反應(yīng)測(cè)定UGT總酶的活性,該方法操作過程極為煩瑣,且檢測(cè)準(zhǔn)確度較低[7]；熒光法主要以熒光試劑作為底物(如對(duì)羥基聯(lián)苯、7-羥基-4-甲基香豆素),方法雖然簡(jiǎn)單,但易受干擾[8,9]；有學(xué)者[10]以丙泊酚為底物,利用LC-MS法測(cè)定UGT1A9酶活性,該法靈敏度高、準(zhǔn)確性和專屬性較好,但丙泊酚是一種靜脈麻醉藥,屬于管制藥品,不易獲得。與其他方法相比,本試驗(yàn)選擇的UGT底物是常見的化學(xué)試劑,廉價(jià)、易獲得,其葡萄糖醛酸化反應(yīng)專屬性較好。兩組方法前處理簡(jiǎn)單、測(cè)定技術(shù)普及率高、方法靈敏、定量準(zhǔn)確、專屬性好,故可以為UGT酶活性測(cè)定提供有效的分析方法。

參考文獻(xiàn)

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Determination of UGT Substrates in Rats' Liver Microsomes by HPLC

HONGLi-xia,LVHong-xia,SHIMing-xin,WANGJia-hui,DAIJing*

(SchoolofPharmacy,ChengduMedicalCollege,Chengdu610083,China)

Objective To establish a HPLC method for the determination of UGT substrates in isolated rat liver microsomes. Methods P-nitrophenol and acetaminophen were chosen as UGT substrates, with phenacetin and caffeine as internal standards, respectively. The determination was performed on a Welchrom C18 column, with mobile phase of p-nitrophenol was acetonitrile-0.01mol/L ammonium acetate (pH 5.00=35∶65，and for acetaminophen was acetonitrile -water=14∶86. The flow rate was 1 mL/min. Detection wavelength of p-nitrophenol and acetaminophen were set at 316 nm and 244 nm. The column temperature was 30 ℃, and injection volume was 20 μL. Results The linear ranges of p-nitrophenol and acetaminophen were 0.5-100 μmol/L. The intra-and inter-assay precisions of p-nitrophenol were less than 14.7%，the assay recoveries were between 89.9% and 111.0%, and the extract recoveries were greater than 86.5%. For acetaminophen, the intra-and inter-assay precisions were less than 13.0%, the method recoveries were between 105.6% and 114.2%, and extraction recovery was greater than 78.3%. Conclusion The two methods were sensitive, simple and accurate. which can be applied for determination of UGT enzyme activity in isolated rat liver microsome.

HPLC; Uridine Diphosphate Glucuronosyltransferase; P-Nitrophenol; Acetaminophen; Liver Microsomes

國(guó)家級(jí)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目(NO：20133705006)；四川省教育廳理科重點(diǎn)項(xiàng)目(NO：12ZA026)；成都醫(yī)學(xué)院大學(xué)生創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目(NO：CX201103)

代晶,E-mail：daijing320@126.com

http://www.cnki.net/kcms/detail/51.1705.R.20140417.1420.003.html

10.3969/j.issn.1674-2257.2014.02.003

R969.2

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