超高倍多媒體顯微儀檢測沙眼衣原體及支原體的可靠性研究▲

陳巧佩 李穎豐 倪少娟 唐玉群 周春浪 佘尚揚(yáng)

(廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院，廣西壯族自治區(qū)婦產(chǎn)醫(yī)院，南寧市 530003)

超高倍多媒體顯微儀檢測沙眼衣原體及支原體的可靠性研究▲

陳巧佩 李穎豐 倪少娟 唐玉群 周春浪 佘尚揚(yáng)*

(廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院，廣西壯族自治區(qū)婦產(chǎn)醫(yī)院，南寧市 530003)

目的探討超高倍多媒體顯微儀直接鏡檢法在檢測衣原體、支原體感染上的可靠性。方法取女性宮頸分泌物直接涂片后置于超高倍多媒體顯微儀(MMDI)鏡下直接觀察涂片，抽取MMDI支原體、衣原體陽性標(biāo)本及陰性標(biāo)本各132例，再用熒光定量PCR(FQ-PCR)法檢測沙眼衣原體(CT)和解脲脲原體(UU)，以PCR為“金標(biāo)準(zhǔn)”分析MMDI的檢測靈敏度及特異度。結(jié)果納入實(shí)驗(yàn)的132例超高倍顯微儀鏡檢陽性的標(biāo)本中，PCR-熒光探針法顯示CT陽性者12例，UU陽性者59例，36例為CT和UU均陽性，25例為PCR陰性；132例MDDI檢測為陰性的樣本其PCR-熒光探針法檢出CT或UU陽性4例。結(jié)果判定改為支原體、衣原體是否陽性后，MMDI和PCR結(jié)果經(jīng)成組卡方檢驗(yàn)表明兩種檢測方法的結(jié)果有很好的相關(guān)性。以PCR作為金標(biāo)準(zhǔn)，264例結(jié)果分析MMDI檢測支原體、衣原體的方法學(xué)性能，得MMDI的靈敏度為96.40%，特異度為83.66%，陽性結(jié)果預(yù)期值為81.06%，陰性結(jié)果預(yù)期值為96.97%。總有效率為89.02%。結(jié)論超高倍多媒體顯微儀直接鏡檢法(MMDI)在快速篩查支原體、衣原體感染上具有不可取代的優(yōu)勢，尤其是在支原體、衣原體的排除診斷中具有極其重要的價(jià)值；MMDI技術(shù)能對(duì)分泌物的整體微生態(tài)狀態(tài)進(jìn)行評(píng)價(jià)，為疾病診斷提供全面的病理信息；MMDI技術(shù)在區(qū)分衣原體、支原體上尚存在不足，對(duì)于MDDI篩選出的支原體、衣原體陽性標(biāo)本可通過PCR進(jìn)一步鑒定。

超高倍顯微儀；聚合酶鏈反應(yīng)；解脲脲原體；沙眼衣原體

非淋菌性尿道炎(nongonococcal urethritis，NGU)也稱非特異性生殖道感染(non-specific genital infection，NSGI)，是指由淋菌以外的其他病原體，主要是沙眼衣原體(ChlamydiaTrachomatis，CT)、尿素分解支原體(UreaplasmaUrealyticum，UU)所引起的尿道炎，是最常見的性傳播疾病之一。通常NGU的概念包括男性的非淋菌性尿道炎和淋病后尿道炎以及女性的非淋菌性尿道炎和非淋菌性宮頸炎。目前，性傳播疾病(STD)在我國的發(fā)病率呈不斷上升趨勢，2000年全國報(bào)道該病在我國重點(diǎn)防治的8種主要性傳播疾病中已升至第二位[1，2]，其中沙眼衣原體感染引起的STD還呈逐年上升趨勢[3]。因此，有必要建立一種快速、準(zhǔn)確的支原體、衣原體篩查方法。

超高倍多媒體顯微儀(multimedia microscopy diagnostic instrument，MMDI)直接鏡檢法可以進(jìn)行分泌物病原體篩查、尿沉渣鏡檢、大便有形成分鏡檢及血液學(xué)形態(tài)相關(guān)檢查等。該技術(shù)為診斷泌尿生殖道感染提供了一項(xiàng)快速、直觀的新方法。為了探討MMDI新技術(shù)在分泌物病原體篩查方面的可行性，尤其是在支原體、衣原體檢測方面的性能，我們將其檢測結(jié)果與PCR-熒光探針法進(jìn)行了比較和分析。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2010年10月至2013年7月廣西壯族自治區(qū)婦幼保健院婦產(chǎn)科、婦科門診及生殖中心就診的女性患者668例，患者均疑為宮頸炎、尿道炎及不孕患者，年齡20～36歲。用無菌棉拭子取宮頸分泌物：首先用一根棉拭子擦去宮頸表面多余黏液，再用棉拭子插入宮頸1～2 cm處緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)一周并停留10 s后，取出棉拭子置于無菌管中送檢。經(jīng)MMDI檢測共選取264例樣本，其中132例為取宮頸分泌物標(biāo)本用MMDI鏡檢法篩查CT、UU陽性(組1有51例衣原體陽，組2有78例支原體陽，組3有3例衣原體、支原體均陽性)，132例為MMDI鏡檢非衣原體、支原體患者(組4)。該264例標(biāo)本再行PCR-熒光探針法檢測CT和UU。

1.2 主要儀器和試劑 超高倍多媒體顯微分析儀為上海大眾公司DZ-510型；核酸檢測(PCR-熒光探針法)試劑盒購自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司。采用美國ABI-5700定量PCR檢測儀。

1.3 MMDI鏡檢 標(biāo)本送檢后即時(shí)用無菌生理鹽水涂片，加蓋玻片，在放大12 000倍的相差視野下觀察CT形態(tài)。觀察到以下特點(diǎn)之一即判斷為衣原體陽性：① 在柱狀上皮細(xì)胞內(nèi)或移行上皮細(xì)胞內(nèi)有許多做“布朗運(yùn)動(dòng)”的膜狀圓形顆粒(衣原體顆粒)，細(xì)胞內(nèi)可見衣原體包涵體。包涵體為宿主細(xì)胞漿的空泡內(nèi)充滿始體和原體所形成[4]，高倍鏡下為內(nèi)膜環(huán)繞的空泡內(nèi)有數(shù)量不等的衣原體顆粒作“布朗運(yùn)動(dòng)”；②觀察到衣原體包涵體隨胞膜破裂釋放出細(xì)胞外[5～7]。見圖1和圖2。觀察到以下特點(diǎn)：實(shí)體的小顆粒結(jié)構(gòu)，但是單個(gè)的很難觀察肯定，一般都是聚集成團(tuán)形成包囊，包囊無細(xì)胞核，其大小是中性粒細(xì)胞的1/2～2/3大小，包囊內(nèi)顆粒較均勻，呈翻滾樣運(yùn)動(dòng)。即可判斷為支原體陽性[8～10]。見圖3～圖4。

圖1 柱狀上皮內(nèi)衣原體相差視野×12 000

圖2 衣原體包涵體從細(xì)胞內(nèi)釋出相差視野×12 000

圖3 支原體相差視野×12 000

圖4 支原體相差視野×12 000

1.4 熒光探針定量PCR 該法除了常規(guī)引物外，PCR反應(yīng)體系中含能與PCR產(chǎn)物雜交的熒光雙標(biāo)記探針。反應(yīng)中產(chǎn)生的游離熒光標(biāo)記物和PCR產(chǎn)物的量成正比。DNA提取及熒光定量PCR反應(yīng)條件嚴(yán)格按照試劑盒操作進(jìn)行。每次檢測均設(shè)3個(gè)陽性對(duì)照、3個(gè)陰性對(duì)照，均按試劑盒提供的定量陽性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品做定量陽性質(zhì)控，行PCR擴(kuò)增后進(jìn)行結(jié)果分析。實(shí)驗(yàn)灰度區(qū)采取重復(fù)實(shí)驗(yàn)，嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行結(jié)果判定。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)或配對(duì)卡方檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 MMDI鏡檢法 668例宮頸分泌物標(biāo)本，共檢出CT、UU陽性132例，MMDI鏡檢法兩種病原體總陽性檢出率為19.76%。

2.2 熒光探針定量PCR法 132例MMDI鏡檢法陽性的樣本中，PCR-熒光探針法顯示CT陽性者12例，UU陽性者59例，36例為CT和UU均顯示陽性，PCR兩種病原體總陽性檢出率為16.02%，CT感染率為7.19%，UU感染率為14.22%，其中單項(xiàng)感染占66.36%，合并感染占33.64%。兩種方法的對(duì)應(yīng)結(jié)果見表1。

表1132例MMDI陽性樣本與PCR法檢測結(jié)果比對(duì)(n)

此外，132例陰性對(duì)照中，檢出沙眼衣原體或支原體陽性4例。MMDI的真陰性率約為96.97%。

2.3 MMDI和PCR法檢測結(jié)果 MMDI和PCR的陽性結(jié)果不區(qū)分支原體和衣原體，只要檢測到支原體或者衣原體均判定為陽性，兩種檢測方法的結(jié)果有很好的相關(guān)性。兩種檢測方法的檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另，以PCR作為金標(biāo)準(zhǔn)，以這264例結(jié)果分析MMDI檢測支/衣原體的方法學(xué)性能，可得出MMDI的靈敏度為96.40%，特異度為83.66%，陽性結(jié)果預(yù)期值為81.06%，陰性結(jié)果預(yù)期值為96.97%，總有效率為89.02%。見表2。

表2264例樣本MMDI鏡檢法與PCR法結(jié)果比較(n)

3 討 論

衣原體和支原體都是原核細(xì)胞型微生物，體積均較小，形態(tài)特征有一定的相似性，在超高倍鏡下明確區(qū)分兩者有一定難度。

我們的研究中MMDI判定為衣原體陽性的51例標(biāo)本中有8例PCR為UU陽性，22例為CT和UU同時(shí)陽性；MMDI判定為支原體陽性的78例標(biāo)本的PCR結(jié)果中也有2例CT陽性，12例CT和UU同時(shí)陽性。依據(jù)我們用MMDI判定衣原體、支原體的標(biāo)準(zhǔn)及區(qū)別：衣原體為專性細(xì)胞內(nèi)寄生，宮頸柱狀上皮細(xì)胞為易感細(xì)胞。超高倍鏡檢必須在柱狀上皮細(xì)胞或移行上皮細(xì)胞內(nèi)見到衣原體包涵體或數(shù)量不少的衣原體顆粒才能判斷為CT陽性。超高倍鏡檢觀察到游離包囊，包囊內(nèi)有呈翻滾樣運(yùn)動(dòng)，大小較均勻的顆粒判斷為支原體陽性。我們的研究表明，MMDI技術(shù)在區(qū)分衣原體和支原體上仍然存在缺陷。支原體包囊存在于細(xì)胞外，衣原體包涵體在細(xì)胞內(nèi)外都有存在，但由于脫出細(xì)胞外的衣原體、包涵體與支原體包囊兩者在大小上相似，僅靠形態(tài)學(xué)不能很好的區(qū)分。此外，支原體并非完全是表面寄生菌，在近期的研究中發(fā)現(xiàn)，支原體也可進(jìn)入上皮細(xì)胞的核和細(xì)胞漿中繁殖[10]，這可能也是造成我們研究中MMDI檢測在形態(tài)學(xué)上判定為衣原體而PCR檢測為支原體的原因之一。

一般而言，對(duì)衣原體感染有效的藥物對(duì)支原體感染也有效。這使得區(qū)分兩者的意義并不是很大，因此，我們后面的數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)沒有再區(qū)分支原體、衣原體感染，將判定陰陽的標(biāo)準(zhǔn)改為支/衣原體陰性或者陽性。改變判定標(biāo)準(zhǔn)后MMDI結(jié)果和PCR結(jié)果進(jìn)行成組卡方檢驗(yàn)結(jié)果顯示P<0.05，可以認(rèn)為兩種檢測方法的結(jié)果有很好的相關(guān)性。但，配對(duì)χ2檢驗(yàn)(McNemar Test)，P<0.05(雙側(cè))可認(rèn)為兩種檢測方法的檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這一結(jié)果提示我們，若MMDI鏡檢所見不是典型形態(tài)特征的時(shí)候，其陽性結(jié)果需要進(jìn)一步用PCR確定。利用MMDI技術(shù)對(duì)分泌物進(jìn)行檢測而未經(jīng)PCR確認(rèn)的結(jié)果時(shí)將支原體、衣原體統(tǒng)稱為支/衣原體來報(bào)告更為合適。我們的研究中132例MMDI檢測為非支原體、衣原體感染的患者對(duì)應(yīng)的PCR結(jié)果只有4例陽性，在這132例MMDI檢測為陰性的樣本中用PCR驗(yàn)證可知其真陰性率可達(dá)到96.97%，表明MMDI法雖然存在一定比例的假陽性，但是卻能夠很好的排除支原體、衣原體感染。另外，以PCR作為“金標(biāo)準(zhǔn)”，以這264例結(jié)果分析MMDI檢測支/衣原體的方法學(xué)性能，可得MMDI的靈敏度為96.40%，特異度為83.66%，陽性結(jié)果預(yù)期值為81.06%，陰性結(jié)果預(yù)期值為96.97%。這組數(shù)據(jù)說明MMDI在檢測支/衣原體的感染中具有靈敏度高于特異度，陰性預(yù)期值高于陽性預(yù)期值的特點(diǎn)。因此，MMDI在排除支、衣原體方面具有很大價(jià)值。也說明該技術(shù)在篩查支、衣原體上會(huì)有很大的應(yīng)用空間。本研究結(jié)果MMDI的陰性預(yù)期值和徐喜林[11]的研究結(jié)果中該指標(biāo)相近，但陽性預(yù)期值低于該報(bào)道。

熒光定量PCR融合了PCR核酸擴(kuò)增和特異性熒光探針的技術(shù)特點(diǎn)，具有高敏感和高特異的優(yōu)點(diǎn)。近年來的研究表明，該法是目前準(zhǔn)確性及重復(fù)性均得到國際公認(rèn)的核酸分子定量定性檢測的標(biāo)準(zhǔn)方法[12，13]。此外，PCR結(jié)果表明，納入研究的132例MDDI陽性標(biāo)本中有25例其PCR為陰性結(jié)果，究其原因可能是我們本次PCR所檢測的是支原體和衣原體都只是在生殖道發(fā)病率最高的解脲脲原體、沙眼支原體，而實(shí)際上除了這兩種以外還有其他種類的支原體或者衣原體，如人型支原體(M.humenis，MH)、生殖支原體(M.genitalium，MG)、副衣原體(Parachlamydiaceae)等。此外，雖然PCR具有很高的靈敏度，但是由于樣本中存在的PCR抑制物及PCR在檢測活動(dòng)期感染方面存在缺陷等都可能導(dǎo)致PCR結(jié)果出現(xiàn)假陰性。本研究表明PCR技術(shù)能夠很好地區(qū)分衣原體、支原體感染。

本研究表明，支/衣原體在本院婦科門診及生殖中心就診的女性患者中的陽性檢出率為16.02%，衣原體感染檢出率約為7.19%，支原體的檢出率約為14.22%。該結(jié)果和國外報(bào)道的衣原體在宮頸的感染率為4%～33%一致[14]，其具體的感染率區(qū)別和所檢測的人群相關(guān)，在性傳播疾病及不孕患者中感染率更高[15]。造成支原體、衣原體檢出率偏低的原因有很多，如衣原體寄生在上皮細(xì)胞內(nèi)，采樣若沒有采到上皮細(xì)胞，勢必造成假陰性，取材不當(dāng)也可降低支原體的檢出率。此外，實(shí)驗(yàn)操作如DNA提取不徹底等都可能造成假陰性。

回顧現(xiàn)有的檢測支原體、衣原體的手段主要有三大類：即經(jīng)典細(xì)胞生物學(xué)方法、免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)檢測方法。傳統(tǒng)檢測支、衣原體的方法技術(shù)要求高，操作復(fù)雜、費(fèi)時(shí)，陽性信息容易丟失。尤其是衣原體為專性細(xì)胞內(nèi)寄生，培養(yǎng)法特異性高，但對(duì)設(shè)備及技術(shù)要求均高，所需時(shí)間長，且培養(yǎng)結(jié)果受培養(yǎng)細(xì)胞及環(huán)境影響[16～18]，如果標(biāo)本培養(yǎng)前保存不當(dāng)造成衣原體死亡，即使存在衣原體同樣培養(yǎng)不出，因此不適于大規(guī)模應(yīng)用于臨床篩查，多用于科研和疑難病例的終鑒定。此外，上述方法無法提供生物體原位、直觀的病變信息。直接免疫熒光法雖然可以在原位鑒定生物體信息，但該技術(shù)依賴生物體的免疫反應(yīng)性且只能檢測特定抗原抗體對(duì)應(yīng)的病原體信息。傳統(tǒng)的直接涂片鏡檢，將樣本涂片通過碘或姬姆薩法等染色后觀察細(xì)胞內(nèi)包涵體，由于細(xì)胞內(nèi)包涵體脆性較大，因而檢測敏感性較低，而且該法的操作也不及MMDI簡便。

MMDI技術(shù)集光學(xué)、光電學(xué)、電子學(xué)、醫(yī)學(xué)影像學(xué)和多媒體計(jì)算機(jī)技術(shù)為一體，具有高放大倍數(shù)、高清晰度的特點(diǎn)，能清晰地直觀生物體的動(dòng)態(tài)和靜態(tài)信息，無需染色，能夠很好地保留細(xì)胞的完整性，因而能提供快速而敏感的像衣原體這種比較難培養(yǎng)的生物體的感染信息。此外，我們知道泌尿生殖道微生態(tài)非常復(fù)雜，有多種病原體如真菌、滴蟲、加德納桿菌、纖毛菌等，若采用PCR、FISH等分子生物學(xué)檢測手段往往只能進(jìn)行特定病原體的檢測。通過MMDI技術(shù)我們可以在同一張涂片中觀察到上皮細(xì)胞、多型核白細(xì)胞、細(xì)菌、真菌、滴蟲等數(shù)量及形態(tài)，為臨床診斷提供全面的分泌物整體微生態(tài)的狀況描述信息，大大提高了多種病原體合并感染的檢出率，是普通顯微鏡所無法比擬的，也是分子生物學(xué)檢測手段目前無法完全替代的。我們研究表明MMDI在檢測衣原體上有較高的靈敏度與其具有高放大倍數(shù)、高清晰度的特點(diǎn)相關(guān)，也和其能夠綜合判定陰道微生態(tài)的特點(diǎn)相關(guān)，因?yàn)橐坏┯幸略w的感染必然會(huì)引起整個(gè)陰道微生態(tài)的改變。

綜上所述，MMDI技術(shù)在分泌物檢查方面能夠?yàn)榕R床快速、簡便、全面地提供相關(guān)信息。此外，由于該項(xiàng)目只需要一臺(tái)多媒體超高倍顯微儀，經(jīng)過形態(tài)學(xué)培訓(xùn)的操作人員，便可對(duì)常溫常規(guī)制備的樣品進(jìn)行檢測，這使得其檢測費(fèi)用也比分子生物學(xué)檢測手段低很多。本研究的數(shù)據(jù)表明，其在排除支/衣原體感染中有極大的價(jià)值，因此該技術(shù)在臨床上很值得作為一種快速過篩檢測方法來推廣。

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StudyonthereliabilityofdetectingChlamydiaTrachomatisandUreaplasmaUrealyticumbymultimediaultramicroscope

ChenQiaopei,LIYingfeng,NIShaojuan,TANGYuqun,ZHOUChunlang,SHEShangyang

(GuangxiMaternalandChildHealthCareHospital;GuangxiObstetricsandGynecologyHospital,Nanning530021,Guangxi,P.R.China)

ObjectiveTo analysis on the reliability of detecting Chlamydia Trachomatis(CT) and Ureaplasma Urealyticum (UU)by multimedia ultramicroscope.MethodsWe used multimedia ultramicroscope to detect the smear of cervical secretions. 132 CT or UU positive specimens and 132 negative specimens had been found and then all of them were detected by fluorescence quantitative PCR (FQ-PCR). The sensitivity and specificity of the multimedia ultramicroscope assay were compared with those of the FQ-PCR using primers.ResultsIn 132 multimedia ultramicroscope positive specimens, FQ-PCR detecting showed 12 CT positive, 59 UU positive, 36 both CT and UU positive, and 25 totally negative. Among 132 multimedia ultramicroscope negative specimens, 4 were found CT or UU positive by FQ-PCR. Two methods showed good correlation when the decision criteria did not distinguish between CT and UU. Considering PCR as golden standard, the sensitivity and specificity of multimedia ultramicroscope were 96.40%, 83.66%, respectively, positive and negative predictive value were 81.06%, 96.97% respectively, and total effective rate was 89.02%.ConclusionsMultimedia ultramicroscope has irreplaceable advantages on rapid screening CT or UU infections, especially in excluding diagnosis. It can also evaluate the whole endovaginal microecologics and provide comprehensive pathological information for diagnosis. However, MMDI is still insufficient in distinguishing between CT and UU, which can be complemented by using PCR.

Multimedia ultramicroscope; Polymerase chain reaction; Ureaplasma urealyticum; Chlamydia trachomatis

廣西自然科學(xué)基金(合同號(hào)：2010GXNSFA013225)

陳巧佩(1982～)，女，碩士，主管技師，研究方向：臨床醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)。

R 446.59

A

1673-6575(2014)05-0542-04

10.11864/j.issn.1673.2014.05.03

2014-07-06

2014-08-29)

*通訊作者