膠原/纖維蛋白膠/載BSA微球復合支架的制備及體外性能研究

陳紅麗 呂潔麗 南文濱 劉 瑞 張 慧郭偉云 劉玲蓉 張其清 井長勤*

1(新鄉(xiāng)醫(yī)學院生命科學技術(shù)學院，新鄉(xiāng) 453003)2(新鄉(xiāng)醫(yī)學院藥學院，新鄉(xiāng) 453003)3(中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院生物醫(yī)學工程研究所，天津 300192)

膠原/纖維蛋白膠/載BSA微球復合支架的制備及體外性能研究

陳紅麗1呂潔麗2南文濱1劉 瑞1張 慧2郭偉云1劉玲蓉3張其清3井長勤1*

1(新鄉(xiāng)醫(yī)學院生命科學技術(shù)學院，新鄉(xiāng) 453003)2(新鄉(xiāng)醫(yī)學院藥學院，新鄉(xiāng) 453003)3(中國醫(yī)學科學院北京協(xié)和醫(yī)學院生物醫(yī)學工程研究所，天津 300192)

為改善組織工程支架材料內(nèi)部營養(yǎng)供應不足及分布不均的問題，制備膠原/纖維蛋白膠/載BSA微球復合支架(SCFM)并研究其理化性質(zhì)及其BSA釋放行為。本研究中采用戊二醛交聯(lián)并冷凍干燥制備多孔膠原海綿支架，纖維蛋白與載BSA的PLGA微球混合后加入凝血酶，注入膠原膜中制備復合支架，研究支架形態(tài)學、孔隙率、機械強度等理化性質(zhì)；通過BCA試劑盒法測定支架內(nèi)部不同部位BSA含量及釋放行為，圓二色譜法檢測BSA的二級結(jié)構(gòu)。掃描電鏡結(jié)果顯示制備的膠原支架孔徑分布均勻,孔徑平均(130±45) μm；相對于膠原/纖維蛋白膠/BSA支架(SCFB)，在體外釋放48 h時累積釋放率為75.20%±2.74 %，隨后BSA即不再顯著增加；而支架SCFM中的BSA釋放時間延長，持續(xù)釋放144 h，測定其累積釋放量為72.36%±3.48 %；測定支架SCFM代表性的3個部位的BSA含量均勻，在釋放96 h內(nèi)均高于支架外BSA含量，且圓二色譜結(jié)果表明BSA二級結(jié)構(gòu)未見異常。支架SCFM可長時間維持支架內(nèi)部BSA含量，且持續(xù)均勻釋放，是理想的組織工程支架材料。

膠原；纖維蛋白；PLGA微球；組織工程支架

引言

支架(scaffold)材料在組織工程研究中起中心作用，它不僅為特定的細胞提供結(jié)構(gòu)支撐作用，而且還起模板作用，引導組織再生并控制組織結(jié)構(gòu)。膠原是一種天然蛋白質(zhì)，廣泛存在于動物的皮膚、骨、肌腱韌帶和角膜等組織中，作為藥物載體及構(gòu)建活性三維支架已得到廣泛認可[1-2]，但在體外培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基中的生長因子等營養(yǎng)物質(zhì)難以擴散到支架材料內(nèi)部并保持均一持續(xù)的作用。因此，實現(xiàn)營養(yǎng)物質(zhì)在支架中的可控制釋放及均一分布對于構(gòu)建三維組織工程支架尤為重要。在支架材料中復合定量的生長因子等營養(yǎng)物質(zhì)，可為細胞的生長、分化和增殖提供養(yǎng)分。但膠原蛋白(collagen)只在酸性環(huán)境中溶解，在中性環(huán)境中由于膠原未能溶解分散，很難使水溶性的蛋白及細胞因子等營養(yǎng)成分分散均勻，因而不能保證營養(yǎng)物質(zhì)持續(xù)均勻的釋放發(fā)揮作用；而膠原蛋白溶解的酸性環(huán)境易導致蛋白及細胞因子的失活。纖維蛋白(fibrin)具有良好的止血功能，但機械強度較差[3-6]；將載細胞因子的微球與纖維蛋白混合后，與膠原復合制備支架，可在一定程度上克服兩種材料的缺點[7-8]，復合間充質(zhì)干細胞作為仿生皮膚覆蓋物用于修復皮膚缺損具有良好的應用前景。

課題組前期研究發(fā)現(xiàn)聚乳酸-羥基乙酸共聚物((poly(lactic-co-glycolic acid)，PLGA)微球及納米粒作為牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)的載體可以保護其活性并延緩其釋放速率[9-10]。結(jié)合前期的研究成果，本研究以BSA作為細胞因子及蛋白多肽的模擬，先將BSA包裹制備成微球，然后與纖維蛋白及膠原復合制備膠原/纖維蛋白膠/載BSA微球復合支架(SCFM)，考察其形態(tài)學、機械強度等影響，并研究BSA體外釋放行為，支架內(nèi)不同部位BSA含量。重點考察支架內(nèi)部不同部位及釋放液中的BSA濃度及其隨時間的變化趨勢，以及釋放后的BSA的蛋白二級結(jié)構(gòu)變化。期望制備的支架SCFM達到克服現(xiàn)有支架材料內(nèi)部細胞因子及其營養(yǎng)成分活性低及分布不均而影響種子細胞在支架內(nèi)的分布不均的缺點，使組織工程支架材料真正達到三維支架的作用[11-15]。為構(gòu)建組織工程化人工器官的研究提供理論基礎和實驗方法，為進一步開展組織工程化人工器官的研究及臨床應用提供一定的科學依據(jù)。

1 材料和方法

1.1主要試劑和儀器

膠原(采用新鮮豬皮通過胃蛋白酶消化法自制，主要為I型膠原,含量>95%)、纖維蛋白膠(廣州倍繡生物技術(shù)有限公司，中國)、牛血清白蛋白(63 000～65 000，北京鼎國生物有限公司，中國)、PLGA(MW30 000～70 000，50∶50，山東省醫(yī)療器械研究所，中國)、BCA蛋白檢測試劑盒(Pierce)、膠原酶(I型，125 U/mg，Sigma，美國)、人纖溶酶(2 U/mg，Sigma，美國)、其余試劑均為市售分析純。

低溫冷凍真空干燥機(Labconco，美國)、掃描電鏡(Zeiss Supra 55VP，德國)、紫外-可見分光光度計(Spectramaxplus384，美國)、圓二色譜儀(Jasco J2810，日本)。

1.2支架的制備

1.2.1膠原支架的制備

根據(jù)前期結(jié)果取0.6 %的膠原溶漲液冷凍干燥，通過戊二醛交聯(lián)后再次冷凍干燥，制備得到膠原海綿支架(SC)[2]。

1.2.2載BSA的PLGA微球的制備

采用液中干燥法制備微球[9-10,16]，簡述如下：200 mg PLGA溶于4 mL二氯甲烷中，將0.5 mL含 BSA的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.2)溶液轉(zhuǎn)入PLGA溶液中，乳勻后轉(zhuǎn)入1 %PVA溶液中，攪拌4 h，待有機溶劑揮發(fā)后在15 000 r/min離心下收集微球，冷凍干燥，即得載BSA的PLGA微球。

1.2.3膠原/纖維蛋白膠/ 載BSA微球復合支架(SCFM)的制備

將載BSA的微球或BSA與纖維蛋白原(1∶10，w/w)混合均勻，在上述混合液中加入凝血酶后，立即加入制備好的支架SC中(纖維蛋白膠：膠原=1:3，w/w)，分別得到膠原/纖維蛋白/載BSA微球復合支架(SCFM)膠原/纖維蛋白/ BSA復合支架(SCFB)。

1.3形態(tài)學觀察及孔隙率測定

制備的支架材料置入液氮冷凍定型后，取出切成小試片，取其表面和截面置于金屬片上，真空噴金處理后，掃描電鏡觀察支架材料表面形態(tài)和截面形貌，并測量每個支架的平均孔徑。

常溫下，25 mL 的刻度瓶加入無水乙醇至刻度，稱重記為m1，把重m的樣品浸入其中，24 h 時用吸管吸去刻度以上的無水乙醇，再稱重記為m2，把浸滿無水乙醇的樣品取出，稱量刻度瓶與剩余無水乙醇的質(zhì)量，記為m3。支架材料的孔隙率K表示為

(1)

1.4支架材料的吸水性測定、pH值及機械強度測定

取每種支架材料各5個樣品，精確稱重后，室溫下分別浸泡于PBS溶液中，2 h時取出支架，濾紙上吸去多余水分精確稱重，吸水率表示為

(2)

樣品分別放入試管內(nèi)，加入10 mL去離子水，將材料完全浸沒，振搖樣品使其分散，37℃下浸提72 h。用pH計測量各樣品浸提液和同等條件下靜置72 h雙蒸水的pH值。

取每種支架樣品各5個，剪成條狀，計算其表面積，用電子拉力試驗機進行拉伸強度的測試(夾具間距為20 mm，拉伸速度為100 mm/min)，檢測其斷裂強度。

1.5BSA含量測定及結(jié)構(gòu)測定

精密稱取SCFM支架(10.00.5)mg，投入10 mL 釋放池中，釋放介質(zhì)為PBS(pH 7.2)，空氣浴振蕩器中(371)℃、(751) r/min振蕩，固定時間間隔，吸取支架三處(A，B，C)及釋放介質(zhì)液體(D)(取樣部位如圖3)各 25 μL，補充等量新鮮PBS，用微量BCA試劑盒測定BSA濃度，計算各部位釋放量以及累積釋放量，并繪制釋放曲線。

1.6支架SCFM降解后形態(tài)學觀察

精確稱取SCFM支架(10.00.5)mg放入試管，加入10 mL 降解介質(zhì)，降解介質(zhì)為含I型膠原酶(10 U/mg)和纖溶酶(0.1 U/mg)的PBS(pH 7.2)，空氣浴振蕩器中(371) ℃、(751) r/min振蕩，分別于48、96、144 h時取出后，冷凍干燥，掃描電鏡觀察支架材料表面形態(tài)。為防止蛋白酶的降解失活，每隔48 h更新等體積新鮮降解介質(zhì)。每組取 3 個樣品，重復3次。

1.7統(tǒng)計學分析

測量結(jié)果用SPSS11.0軟件包處理，實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差表示，樣本均數(shù)間比較采用t檢驗，3種支架的釋放采用方差分析，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1材料的形貌結(jié)構(gòu)

載BSA的PLGA微球光滑圓整，無凝聚粘連等現(xiàn)象(見圖1)，粒徑為(22.4±6.2)μm，包封率為86.21%±2.31%，載藥量為7.65%±0.84%。將微球與纖維蛋白膠混合后可見分散均勻；加入膠原支架制備的復合支架SCFM中微球分散較均勻。圖1(c)所示的膠原支架SC的橫斷面，支架內(nèi)微孔彼此相通，三維結(jié)構(gòu)清晰，孔隙大小均一。SEM下標尺測定支架材料的孔徑在100 ～200 μm。

2.2支架材料的吸水性能、pH值及機械強度測定

如表1所示，3種支架SCFM、SCFB和SC吸水率分別為44.25 %±4.645 %、45.67 %±5.143 %和48.34 %±4.65 %，未見明顯差異(P> 0.05)。經(jīng)過72 h浸泡后得到的各種浸提液和雙蒸水的pH值測定結(jié)果顯示，支架浸提液的pH值在中性范圍。浸提液pH值在6.7～7.1，與人體正常pH值范圍相符。3種支架材料的斷裂強度測量表明，纖維蛋白膠及微球的加入對于膠原支架斷裂強度未見顯著影響(P> 0.05)。

2.3BSA含量及釋放行為測定

如圖2所示，3種支架在最初的12 h內(nèi)均表現(xiàn)出突釋BSA效應，支架SCFBBSA釋放量52.31%±2.36 %，SCFM與SCM分別為為26.30%±2.21 %，20.23%±2.04 %。在48 h時，SCFBBSA累積釋放量為75.20%±2.74 %，隨后釋放量未見明顯增加；SCM突釋BSA效應小，釋放速率較慢，但是在96 h時BSA含量即不再增加。SCFM表現(xiàn)出緩慢較平穩(wěn)的釋放，48 h釋放量為40.92%±2.13 %，144 h時為72.36%±3.48 %。3種支架釋放行為采用組件方差分析進行統(tǒng)計分析，P=0.027，具有顯著性差異。

圖1 支架掃描電鏡圖。(a)微球；(b)SCM；(c)SC；(d)SCFBFig. 1 SEM images of scaffold.(a)Microspheres；(b)SCM；(c)SC；(d)SCFB

表1支架材料(n=5,x±s)的孔隙率、pH值，機械強度測定結(jié)果

Tab.1Porosity,pHandbreakingstrengthofdifferentkindsofscaffolds(n=5,x±s)

樣品孔隙/nm吸水率/%pH值斷裂強度/(N/mm2)SC150±5548 34±4 6506 89±0 760 564±0 010SCFB146±4045 67±5 1437 08±0 970 576±0 006SCFM130±4544 25±4 6456 78±1 230 570±0 012蒸水——7 24±1 46—

圖2 支架體外釋放BSA圖。(a)144 h累計釋放圖；(b)12 h累計釋放示意圖 (n=3)Fig.2 The release of BSA from scaffolds in vitro.(a)The release of BSA from scaffolds in 144 h;(b)The release of BSA from scaffolds in 12 h (n=3)

圖3 支架SCFM BSA含量.(a)不同部位BSA的濃度隨時間變化圖；(b)支架取材部位示意圖，其中A為支架圓心中部，B為半徑的中心，C為邊緣內(nèi)側(cè)，D為釋放介質(zhì))(n=3)Fig.3 BSA concentration in SCFM scaffolds.(a)BSA concentration in SCFM scaffolds；(b)Diagram of extracted from different parts of SCFM scaffolds， A: at the center of the scaffold; B: at the center of semidiameter; C: at the edge of scaffold; D: out release medium phase (n=3)

測定SCFM支架內(nèi)及釋放液中BSA的濃度(如圖3所示)，結(jié)果表明所選4處(A、B、C和D)不同部位的BSA 濃度隨時間不斷升高，并且支架材料內(nèi)A、B和C處濃度隨時間增速幾乎相同，其中24 h時各處濃度順序為CA>CB>CC>CD(P<0.01)。96 h之前所測釋放液中BSA濃度均小于支架內(nèi)部各處(P< 0.05)。在144 h時支架各處濃度基本達到一致。支架A處、B處和C處分別與釋放液D處組間兩兩比較，P< 0.05，具有顯著差異。但是，A處、B處和C處任兩者之間組間比較沒有顯著性差異(P> 0.05)。

2.4BSA圓二色譜(CD)分析

圖5 支架SCFM體外降解一定時間時掃描電鏡圖。(a)48 h；(b)96 h；(c)144 hFig.6 SEM images of SCFM scaffold following in vitro degradation.(a)48 h；(b)96 h；(c)144 h

BSA的CD譜圖是典型帶有α-螺旋結(jié)構(gòu)的譜圖，即在222 nm和 208 nm附近處表現(xiàn)出兩個負的特征肩峰譜帶[17-18]。支架SCFM置于PBS溶液24 h和48 h時，由于不同時間釋放的BSA濃度不一致，與等濃度的游離BSA光譜數(shù)據(jù)相比，釋放的BSA譜圖形狀和肩峰的位置未發(fā)生明顯移動，釋放的BSA的CD光譜未發(fā)現(xiàn)異常，α-螺旋及β-折疊的含量分別與等濃度的游離BSA光譜數(shù)據(jù)也未見明顯差異(P< 0.05)(見圖4)。

圖4 支架SCFM 24和48 h時釋放液中BSA 圓二色譜儀圖Fig. 4 Criculardichroism spectra of BSA released from the SCFM scaffolds at 24 and 48 h

2.5支架SCFM降解后形態(tài)學觀察

在含有低濃度的膠原酶和纖溶酶的降解液中孵育一定時間，支架SCFM經(jīng)重新凍干后肉眼觀察都不同程度變得疏松柔軟，且表面粗糙。SEM觀察(見圖5)48 h時，支架SCFM仍保持較完整結(jié)構(gòu)，其中分布的PLGA微球呈現(xiàn)輕微的變形，但仍包裹于支架中；96 h時支架的空隙增大，其中微球已經(jīng)變形，可觀察到其中分部的完整的微球以及釋放一段時間后變形及聚集的微球，并且微球數(shù)量亦相應減少，降解介質(zhì)中出現(xiàn)較多的絮狀沉淀；體外降解144 h時，肉眼觀察支架疏松多孔，且失去固定形態(tài)，SEM觀察支架SCFM空隙多而大，當中微球已經(jīng)較少，鏡下幾乎不可見。

3 討論

膠原可制備成多孔結(jié)構(gòu)材料是其可用于組織工程支架材料的一個突出特點。支架材料給細胞提供一個穩(wěn)定的三維生長空間，并保持足夠的孔隙率，供細胞在其中進行物質(zhì)交換、生長代謝、引導組織形成[2]。制備的支架材料孔徑分布均勻，且支架內(nèi)部孔徑相互貫通，因此保證種子細胞在支架材料上的黏附、增殖和分化不受影響。復合支架材料具有有一定的機械強度、柔韌性。其酸堿性直接影響細胞的粘附以及生物相容性。盡管膠原分散在稀酸溶液中，但經(jīng)過兩次凍干以及堿性交聯(lián)液的作用，大大減少了酸性物質(zhì)的殘留。

在支架材料中復合定量的生長因子等營養(yǎng)物質(zhì)，為細胞的生長、分化和增殖提供營養(yǎng)至關(guān)重要。但是支架內(nèi)部模擬體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的持續(xù)作用同樣關(guān)鍵。因為作為理想的組織工程支架，在組織工程支架材料上體外培養(yǎng)細胞的質(zhì)量主要表現(xiàn)在細胞與支架材料各處的黏附融合以及細胞在支架均勻的生長、增殖情況[19]。本研究以BSA為蛋白模型，考察不同復合方式的支架內(nèi)BSA的濃度及釋放行為。支架SCFM中的BSA釋放時間延長，持續(xù)釋放144 h，測定其累積釋放量為72.36%±3.48%，支架SCM突釋BSA效應小，釋放速率較慢，但是在96 h時BSA含量即不再增加，推測是由于制備過程中，載BSA的微球需要較長時間與膠原混合，因此導致微球表面的BSA損失，使得支架的BSA含量減少。24 h 支架SCFB出現(xiàn)第二個突釋效應，推測是由于纖維蛋白膠的部分降解和崩解導致BSA的大量釋放；在48 h時，支架SCFBBSA累積釋放量為75.20%±2.74 %，隨后釋放量未見明顯增加。支架SCFM釋放液中BSA濃度在釋放96 h之前，均小于支架內(nèi)部各處(P< 0.05)，在144 h時支架各處濃度基本達到一致，也證實BSA釋放后經(jīng)過一定時間的擴散及滲透才能達到各部位濃度均一。因此支架SCFM可長時間維持支架內(nèi)部BSA含量，且持續(xù)均勻釋放，一定程度改善了僅靠培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)的作用無法滿足接種在支架各處細胞融合、生長、分化和代謝等，也一定程度改善了與營養(yǎng)物質(zhì)支架復合導致不能持久作用的缺點，從而克服了導致細胞無法進入支架內(nèi)部的缺陷。

由于I型膠原在體內(nèi)的特異性降解酶為I型膠原酶，而纖維蛋白膠在體內(nèi)纖溶酶作用下能夠降解并逐漸吸收。為了更好的模擬體內(nèi)局部體液環(huán)境，降解介質(zhì)選用pH7.2的 PBS，并且加入一定量的I型膠原酶和纖溶酶研究其降解過程中支架形態(tài)學變化，初步探索支架體外降解對于載BSA微球釋放的影響。在48h，96h時微球變形，但仍見大量的微球附著于支架內(nèi)，一定程度說明在體外培養(yǎng)過程中可長時間保持支架內(nèi)部微球的量即BSA的含量。膠原/纖維蛋白膠在體內(nèi)的降解與BSA的釋放時間密切相關(guān)，因為BSA的釋放受濃度梯度和限制性生物可降解膜降解兩方面因素影響，膠原及纖維蛋白等生物材料的體內(nèi)降解受多種酶及環(huán)境因素的聯(lián)合作用，不完全等同于體外降解情況，體內(nèi)的釋放及其降解性質(zhì)還需要進一步的研究。

蛋白質(zhì)分子構(gòu)象是其生物功能的基礎，多肽蛋白質(zhì)類營養(yǎng)物質(zhì)具有復雜的一級結(jié)構(gòu)和嚴格的空間結(jié)構(gòu)，任何導致蛋白質(zhì)折疊結(jié)構(gòu)解體或松散以及損害三維結(jié)構(gòu)的因素都會影響其生物活性，圓二色譜是研究稀溶液中蛋白質(zhì)構(gòu)象的一種快速、簡單、較準確的方法。圓二色譜結(jié)果顯示釋放的BSA譜圖形狀和肩峰的位置未發(fā)生明顯移動，α-螺旋及β-折疊的含量分別與等濃度的游離BSA光譜數(shù)據(jù)也未見明顯差異(P< 0. 05)，證明支架內(nèi)BSA二級結(jié)構(gòu)未發(fā)生改變。推測其活性未受影響，保障了支架內(nèi)部持續(xù)均一且有活性營養(yǎng)成分的作用。支架SCFM使其能更好地維持內(nèi)部活性營養(yǎng)物質(zhì)濃度的持續(xù)穩(wěn)定性與均勻性。

4 結(jié)論

本研究制備的支架SCFM實現(xiàn)了BSA在支架中的長時間較均勻分布，支架各部分BSA濃度均一，緩慢釋放，持久作用；調(diào)整微球的量可達到調(diào)整支架內(nèi)部BSA的含量，而且釋放的BSA結(jié)構(gòu)未見顯著改變，活性得到一定保護，保證了支架內(nèi)部持續(xù)均一且有活性營養(yǎng)成分的作用。各種原料廉價易得，制備工藝簡單，制備條件可控，表明支架SCFM是一種較理想的組織工程支架材料，可以保證種子細胞在支架材料上更好的黏附、增殖和分化。

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PreparationandinvitroCharacteristicsofCollagen/Fibrin/BSAMicrospheresComplexTissueEngineeringScaffolds

CHEN Hong-Li1LV Jie-Li2NAN Wen-Bin1LIU Rui1ZHANG Hui2GUO Wei-Yun1LIU Ling-Rong3ZHANG Qi-Qing3JING Chang-Qin1*

1(SchoolofLifeScienceandTechnology,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003,China)2(SchoolofPharmacy,XinxiangMedicalUniversity,Xinxiang453003,China)3(InstituteofBiomedicalEngineering,ChineseAcademyofMedicalSciences&PekingUnionMedicalCollege,Tianjin300192,China)

In order to overcome the problem of nutrition insufficiency and inhomogeneous distribution in tissue engineering scaffolds, a scaffold (SCFM) composed of collagen/fibrin/BSA microspheres was prepared and the features were characterized, especially the release behaviors of BSA. Porous collagen scaffolds for tissue engineering were fabricated by freeze-drying and cross-linking. BSA loaded microspheres mixed with fibrin into collagen scaffolds for SCFM. The physiochemical properties of the scaffolds, such as surface morphology, porosity, pore sizes，mechanical function, and BSA contents in the scaffold were measured. SEM results showed that collagen scaffolds exhibited a highly porous and interconnected structure, the pore size of the material was (130±45) μm. Results of in vitro release tests revealed the BSA released from SCFMwas 72.36%±3.48% of the original amount of BSA encapsulated after 144 h. The cumulative release of BSA from collagen/fibrin/BSA scaffolds (SCFB) within 48 h was 75.20%±2.74 %. There were no significant changes in the further prolonged period after 48 h. The SCFMachieved a relatively constant release and prolonged BSA release properties as compared to the SCFB. It was found that BSA concentration inside of SCFMwas higher than the external release medium before 96 h. The conformations of the BSA from the SCFMdid not have significant changes. The SCFMobtained sustaining release ability and can maintain a homogeneous concentration of the BSA inside the scaffold for a long time. Therefore it provides a kind of promising scaffolds for tissue engineering.

collagen; fibrin; PLGA microspheres; tissue engineering scaffolds

10.3969/j.issn.0258-8021. 2014. 01.012

2012-12-21，錄用日期：2013-08-20

河南省教育廳自然科學研究計劃項目(2011B310006)；河南省科技攻關(guān)項目(122102210148，122102310195)

R318

A

0258-8021(2014) 01-0079-07

*通信作者。E-mail: jingchangqin@xxmu.edu.cn